Hydrogenasen erfüllen in zahlreichen prokaryontischen Organismen mit Wasserstoff-metabolismus wichtige Funktionen im Energiehaushalt.
Bei einer Vielzahl fermentativer Bakterien findet der Wasserstoffmetabolismus nur unter Sauerstoffausschluß statt. In solchen obligat oder fakultativ anaeroben Bakterien werden die in fermentativen Stoffwechselprozessen anfallenden Reduktionsäquivalente durch Oxidation regeneriert, wobei die Elektronen im letzten Schritt durch Hydrogenasen auf Protonen als alleinige Elektronenakzeptoren übertragen werden. Beispiele hierfür sind Arten der Gattungen Clostridium und Escherichia.
Andererseits erlaubt eine Aufnahme und durch die Hydrogenase katalysierte Oxidation die Nutzung von molekularem Wasserstoff als alleinige Elektronenquelle zur Reduktion der terminalen Elektronenakzeptoren wie z.B. Sulfat, Nitrat, Kohlendioxid oder Fumarat (z.B. Desulfovibrio, Pseudomonas und Methanobacterium). Dabei tragen die meist membrangebundenen Hydrogenasen durch die Bildung eines Protonengradienten zur ATP-Produktion bei. Eine Besonderheit stellt hierbei der Wasserstoffkreislauf in sulfatreduzierenden Bakterien dar (Desulfovibrio). Hier wird im Cytosol z.B. Lactat oxidiert und die Elektronen durch eine cytosolische Hydrogenase auf Protonen übertragen. Der entstehende Wasserstoff diffundiert durch die Cytoplasmamembran in das Periplasma, wo er durch eine periplasmatische Hydrogenase oxidiert wird. Die Elektronen werden über ein Cytochrom c3 zurück ins Cytoplasma transferiert, wo sie zur Sulfatreduzierung zur Verfügung stehen. Es entsteht also ein Protonengradient über der Membran, wobei jedoch im Gegensatz zum chemiosmotischen Mechanismus nach Mitchell nicht Protonen, sondern Elektronen durch die Membran transportiert werden.
Aber auch in obligat aeroben Knallgasbakterien (z.B. Alcaligenes), die in Anwesenheit von Wasserstoff als alleiniger Energiequelle und Kohlendioxid als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen, erlaubt die Oxidation von molekularem Wasserstoff und die Elektronenübertragung auf den terminalen Elektronenakzeptor Sauerstoff die Erzeugung von ATP durch Elektronentransportkettenphosphorylierung. In diesen Organismen erfolgt eine direkte Reduktion von NAD+ mit Wasserstoff zu NADH in einer durch die Hydrogenase katalysierten Reaktion. Die Versorgung der Organismen mit ATP und NADH, die in assimilatorischen Stoffwechselvorgängen verwendet werden können, findet also letztlich allein durch die Oxidation von molekularem Wasserstoff statt.
Auch in phototrophen Bakterien (z.B. Rhodopseudomonas, Chlorobium) wurden Hydrogenasen gefunden. Durch sie kann Wasserstoff neben Schwefelwasserstoff und organischen Substraten als Elektronendonator fungieren. Die Produktion von Wasserstoff ist bei ihnen jedoch immer an Fermentationen oder Nitrogenasereaktionen gebunden. Eine Photowasserstoffbildung konnte bei phototrophen Bakterien noch nicht beobachtet werden, obwohl das Redoxpotential des ersten stabilen Elektronenakzeptors bei Grünen Schwefelbakterien theoretisch ausreichen würde, um Protonen mittels einer Hydrogenase zu reduzieren.