Genetische Schaltkreise & Biosensoren

von Lars Hempel

Biosensoren

Genetische Schaltkreise finden in vielen Bereichen der Lebenswissenschaften Anwendung und ein Beispiel sind die Biosensoren, welche mithilfe von genetischen Schaltkreisen „programmiert“ werden können. Biosensoren sind in ihrer Funktion und Form sehr unterschiedlich und können dadurch verschiedenste Aufgaben bewältigen. Biosensoren können aus einfachen Molekülen (z.B. DNA oder Enzyme) über ganze Zellen (auch single cell biosensor) bis zu komplexen Geweben bestehen und die Aufgabenfelder sind genauso vielfältig. Die Biosensoren können u.a. elektrische Potentiale, Temperatur aber auch Konzentrationen detektieren und dann ein Signal zu erzeugen, welches zu einem Ergebnis führt. [Mohanty, 2006]

Die Sensoren bilden ein primäres Element in einer Messkette und müssen aus bestimmten Teilen zusammengesetzt sein. Sensoren bestehen aus einem Aufnehmer, welcher die physikalische Messgröße aufnimmt, einem Wandler, der das Signal umwandelt z.B. ein optisches in ein elektrisches Signal und einen Verstärker, welcher die Signalstärke erhöht. Die Bestandteile müssen bei einem technischen Sensor separat konstruiert und gebaut werden. Bei den Biosensoren können die Bestandteile ineinander übergehen. Das Ziel bei dem Erstellen von Biosensoren ist es, dass die Biosensoren nicht nur ordnungsgemäß funktionieren, sondern eine Bibliothek geschaffen wird mit der die verschiedenen Teile und Module untereinander ausgetauscht bzw. kombiniert werden können. [Hering, 2014]

Bei den Sensoren spricht man von den drei S´s und damit ist die Sensitivität, Stabilität und Selektivität gemeint. Wenn man von einem guten Sensor spricht, müssen alle drei „S“ erfüllt sein. Im Allgemeinen sind technische Sensoren derart konstruiert, dass sie diese Bedingungen erfüllen. [Ritgen,2020] Biosensoren sind nur teilweise menschlich konstruiert, da die Bestandteile in der Natur vorkommen und diese Bestandteile einer gewissen Schwankung unterworfen sind. Wenn ein Protein als Biosensor agiert, können durch eine Mutation oder durch die Umweltbedingungen, die Funktion beeinträchtig werden, wodurch keine gute Messung mehr möglich ist. Die Biosensoren sind aber in den Bereichen der Sensitivität und Selektivität sehr gut aber bei der Stabilität (im Sinne der Reproduzierbarkeit und Wiederverwendbarkeit) liegen unterliegen diese den technischen Sensoren.

In der Abbildung 1 ist das Konzept eines Biosensors verdeutlicht. Aus einem Signal wird ein für den Betrachter besser messbares Signal und in diesen Fall würde der Sensor eine Temperatur oder Konzentration in ein optisches Signal umwandeln.

Arten von Biosenoren

Biosensoren können verschieden physikalische Größen messen und daher ist die Form eines Biosensors sehr unterschiedlich.

Die Enzyme bilden eine große Gruppe von Biosensoren, weil diese sehr klein sind und in großer Zahl produziert werden können. Enzyme reagieren mit dem Nachweisstoff und mithilfe dieser Reaktion kann eine Messung erfolgen. Ein simples Beispiel ist die Katalase, welche Wasserstoffperoxid in Sauerstoff und Wasser spaltet. Nachdem man die Probe und die Katalase zusammengebracht hat, kann die Menge an Sauerstoff bestimmt werden, um eine quantitative Analyse des Wasserstoffperoxids vorzunehmen. Ein anderer Mechanismus wäre ein Farbumschlag oder eine Veränderung eines elektrochemischen Potentials. Die Enzyme könnten auch immobilisiert sein, damit diese wiederverwendet werden. [Alhadrami, 2018]

Rezeptorbasierte Biosensoren ist eine Gruppe von Biosensoren, welche mithilfe von Zellmembranproteinen die chemischen Verbindungen erkennen können. Diese Gruppe besitzt die Fähigkeit die Stoffe zu erkennen aber diese nicht umzuwandeln (im Vergleich zu den Enzymen) und die Rezeptorproteine sind sehr vielfältig und können auf unterschiedlichste Stoffe angepasst seien. Die Analyse kann durch ein optisches Signal erfolgen und die Probleme sind, dass die Rezeptoren eine Membran benötigen, wo sie verankert sind. [Alhadrami, 2018]

Eine weitere Gruppe sind die DNA-Aptamere (im Folgenden auch nur Aptamere genannt). Aptamere sind kleine einzelsträngige DNA-Sequenzen (ssDNA) mit ca. 100 oder weniger Nukleotiden. Die Wirkung entfalten die Aptamere nur in ihrer charakteristischen dreidimensionalen Gestalt, wobei diese hoch spezifisch ist und sich je nach DNA-Sequenz verändern kann. Die Aptamere verfügen über eine hohe Stabilität und Spezifität und können günstig und in großer Masse produziert werden. Die Bindung an bestimmte Bakterien, Viren, Proteine, Hormone, kleine Moleküle oder Ionen ist möglich und dadurch ist der Anwendungsbereich sehr breit. Die Aptamere binden mittel Wasserstoffbrückenbindung und Van-der-Waals-Kräfte an das Ziel und die Herstellung ist relativ simpel. Ein Beispiel wäre der Nachweis von Progesteron mittels DNA-Aptamer-Fluoreszenz. Der Biosensor (auch Aptasensor) kann das Progesteron in geringer Konzentration nachweisen als herkömmliche Techniken und besitzt damit ein großes Potential für klinische Forschung und Entwicklung. [Alhadrami, 2018]

Die Zellbiosensoren (whole cell biosensor or single cell biosensor) sind eine andere Art von Biosensoren. Diese Biosensoren benutzen unter anderem die rezeptorbasierten Biosensoren, um Stoffe zu detektieren aber die Verwendung ist sehr unterschiedlich. Die zellulären Biosensoren besitzen eine komplette Zelle als Grundgerüst und werden im Weiteren näher erläutert.

Grundlagen Biosenoren

Aufgrund der thematischen Einordnung unter Genetische Schaltkreise wird der Fokus auf die zellulären Biosensoren beziehen. Die Detektion von bestimmten Stoffen, wie Arsen oder Kupfer, ist von der Natur aus vorgesehen wurden, da die Mikroorganismen sich von toxischen Stoffen wegbewegen müssen. Die Erkennung erfolgt entweder mithilfe von Rezeptoren auf der Oberfläche der Zelle oder mit Proteinen, die innerhalb der Zelle liegen. Die Stoffe müssen in gelöster Form im Wasser vorliegen im Beispiel von Arsen und Kupfer werden die entsprechenden Ionen As³⁺ und Cu²⁺ von der Zelle erkannt. Diese Proteine sind die Aufnehmer und stehen im direkten Kontakt mit der Probe. Wenn die Ionen erkannt wurden, bindet ein Protein an die DNA und darauf wird GFP (grün fluoreszierendes Protein) freigesetzt, welches als Wandler fungiert. Das GFP kann dann von Beobachter erkannt werden und entweder zur quantitativen oder qualitativen Analyse benutzt werden. Die quantitative Analyse erfolgt dann anhand der Stärke des Leuchtens des GFP und kann dann umgerechnet werden in die Konzentration der Ionen. Der Verstärker ist die Ribosombindestelle und verstärkt das Signal. Die zellulären Biosensoren besitzen verschiedene Vorteile gegenüber den einfachen Molekülen wie auch den komplexen Geweben. Die Zellen sind in ihrer Struktur sehr stabil hingegen einfache Moleküle in einer Lösung schnell inaktiviert oder zerstört werden, weil der pH-Wert zu niedrig ist oder die Lösung Protasen enthält, welche die Enzyme abbaut. Die Zellen vermehren sich automatisch, wenn man ihnen genügend Nahrung zur Verfügung stellt und das genetische Konstrukt wird mitvererbt. Außerdem können die Zellen angepasst werden, damit diese harten Umweltbedingungen standhalten können. Die Geweben müssen erst speziell gezüchtet werden und sind in der Herstellung deutlich komplexer als die Zelllinien. [Wang, 2013]

Genetische Konstrukte: UND-Verknüpfung

Die Proteine und Rezeptoren nutzbar zu machen für die Detektion von Analyten werden die genetischen Konstrukte aufgestellt und analysiert. Der grundlegende Aufbau folgt dem eines technischen Sensors und führt dazu, dass die verschiedenen Module miteinander kombinierbar gemacht werden und vereinheitlich werden können. Die Module sind die verschiedenen Mechanismen, mit denen die Stoffe erkannt werden können und deren Subeinheiten, aus denen ein Sensor besteht. Die Kombination von zwei Signalen ist wichtig, weil viele Faktoren untersucht werden müssen, um z.B. Krebs oder toxische Verschmutzungen zu detektieren und die Verknüpfung mittel der UND-Funktion wird weiter ausgeführt werden. Die Erkennung von zwei Stoffen in einer Probe ist die Aufgabe. Die Zelle besitzt zwei Module mit denen zwei Stoffe erkannt werden können aber der Wandler ist verändert, sodass kein GFP mehr produziert wird. Das GFP wird durch die Proteine hrpR und hrpS (hypersensitive response and pathogenecity) ersetzt, wobei jeder zu messendem Stoff ein Protein ausschüttet. Wenn beide Protein exprimiert wurden sind, dann bindet das Dimer aus hrpR und hrpS an einem dritten genetischen Konstrukt mit dem GFP produziert wird. Bei diesem Konstrukt wurde der Aufnehmer verändert, dass die Signale der beiden ersten Konstrukte als Eingangssignale dienen und das gesamte Gebilde nur ein Signal erzeugt, wenn beide Stoffe im Medium vorhanden sind. Dieser Vorgang passiert in einen Zellkonsortium und schafft die Möglichkeit mit einer Zelle zwei Signale zu erkennen. Die Detektion von drei Stoffen erfolgt über die Kopplung von zwei Zellkonsortien und die erste Zelle ermittelt zwei der drei Stoffe. Diese Zelle gibt an das umliegende Medium einen Stoff ab (3OC₆HSL). Der abgegebene Stoff wird von der zweiten Zelle als Eingangssignal benutz und zusätzlich noch den dritten Stoff und wenn alle vorhanden sind, wird das GFP exprimiert. In der Abbildung 2 ist dieser Vorgang schematisch angedeutet und die zu messenden Moleküle sind rot, grün und graue Kugeln. [Wang, 2013]

Anwendungsgebiete

Die Anwendungsgebiete von Biosensoren sind vielfältig und kommen besonders in den Bereichen der Lebensmittelindustrie, der Medizin aber auch der Pflanzenzüchtung zum Einsatz.

In der Lebensmittelindustrie kann z.B. das Alter von Bieren überprüft werden. Die Überwachung des Alterungsprozesses mithilfe von enzymatischen Biosensoren ist eine gute Methode, um das Bier während der Lagerung zu kontrollieren. Ein weiteres Beispiel ist die Erkennung von Krankheitserregern auf bzw. in Lebensmitteln. Das Bakterium Escherichia coli sollte nicht auf Gemüse gefunden werden, weil diese Bakterien auf eine fäkale Verunreinigung zurückzuführen sind. Um die Bakterien zu detektieren wurde ein potentiometrische alternierende Biosensorsystem eingeführt, damit diese Verunreinigung erkannt wird. Ein weiteres Anwendungsteilgebiet ist die Überwachung von großen Fermentierungsanlagen, wobei hier die Prozesssicherheit und die Produktqualität im Vordergrund stehen. Die Biosensoren werden eingesetzt um verschiedene Substanzen, die für die Fermentation entscheiden sind (Substrat, Produkt, Nebenprodukte), zu detektieren und eine Aussage über die Situation im Reaktor getroffen werden kann. Die eingesetzten Biosensoren erkennen und ermitteln die Konzentration von Laktat, Lysin oder Ethanol. [Alhadrami, 2018]

In der Medizin ist ein bekanntes Beispiel der Glukose-Biosensor und wird bei dem Nachweis und Kontrolle des Blutzuckerspiegels eingesetzt. Der Einsatz erfolgt bei Patienten mit Diabetes mellitus und ist sehr weit verbreitet. Ein anderer Teilbereich ist die Diagnose von Infektionskrankheiten, wie die Harnwegsinfektion. Die Forschung in diesem Gebiet ist sehr ausgeprägt und entwickelt sich stetig weiter. [Alhadrami, 2018]

Probleme

Die Probleme der Biosensoren liegt in der Nachweisgrenze von bestimmten Stoffen. Der Nachweis von toxischen Stoffen kann nur bis zu einem gewissen Wert betrieben werden, weil die Zellen kein Signal senden können, wenn sie in dem Medium nicht bestehen können. Die analysierende Probe hätte damit keine Giftstoffe enthalten, obwohl die Konzentration sehr hoch ist. Hingegen die Nachweisgrenze in der geringeren Konzentration den zellulären Biosensoren keine größeren Probleme bereit, wird die Nachweisbarkeit manchen Stoffen (z.B. Quecksilber oder Cadmium) zu klein, kann man keinen Unterschied feststellen. Der Messbereich muss damit genau definiert werden und die Funktionsfähigkeit der Biosensoren sollte gewährleisten sein. [Wang, 2013]

Ein weiteres Problem stellt die Messung von mehreren Signalen (Anzahl der Signale größer als 3) da, weil man ab zwei Signale bzw. zwei zumessende Stoffe immer ein neues Zellkonsortium braucht. Die Anzahl der Zellkonsortien, die benötigen werden, um X verschiedene Stoffe zu messen, ist X-1 für X > 2 und ein weiteres Problem würde entstehen. Die Verbindung zwischen den Zellkonsortien dürfen nicht die gleichen Stoffe sein, weil sonst der Biosensor eine Messung vorgeben würde, obwohl nicht alle Stoffe in der Probe vorhanden sind. [Wang, 2013]

Perspektive

Die Verwendung von Biosensoren besitzt großes Potential und die Anwendungsbereiche sind sehr vielfältig. Das Fortschreiten der Entwicklung der Nanobiotechnologie ermöglicht den Biosensoren neue Anwendungsbereiche zu erschließen und bereits bestehende Bereiche zu Verbessern.

Die Nutzung von den biologischen Mechanismen (Enzyme, Aptamere, Zelle) zur Detektion von chemischen Stoffen bis zu Krankheiten oder Krankheitserregern ist ein großer Sprung zur technischen Biologie. Die Erweiterung und Verbesserung der biologischen Systeme wird der hauptschwerpunkt der Forschung sein, weil die Kombination verschiedenster Techniken das Optimum aus jeder Biosensor herausholen vermag. Das technische Aufarbeiten der biologischen Systeme und ihrer Komponenten kann ein wertvolles Instrument sein für die Herausforderungen der Zukunft. Das Verständnis über die Funktionsweise und Aufbau der biologischen Systeme, mit denen die Biosensoren hergestellt werden, bringt uns weiter voran an das Wissen über die Biologie und das Leben.

Literatur

• • [Alhadrami, 2018] Alhadrami, H.A. (2018), Biosensors: Classifications, medical applications, and future prospective. Biotechnology and Applied Biochemistry, 65: 497-508
  • [Hering, 2014] Hering, Ekbert, Bressler, Klaus, Gutekunst, Jürgen (2014) Elektronik für Ingenieure und Naturwissenschaftler, Springer Verlag, Abschnitt Sensoren, Volume 1, Pages 298-319
  • [Mohanty, 2006] Mohanty, S. P., & Kougianos, E. (2006). Biosensors: a tutorial review. IEEE Potentials, 25(2), 35–40. https://doi.org/10.1109/mp.2006.1649009
  • [Ritgen, 2020] Ritgen, U. (2020). Analytische Chemie II. Springer Berlin Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-662-60508-0
  • [Wang, 2013] Baojun Wang, Mauricio Barahona, Martin Buck (2013) A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals,Biosensors and Bioelectronics,Volume 40, Issue 1,Pages 368-376