Synthetische Biologie

Komplexe zelluläre Logikverarbeitung unter Verwendung von Ribocomputing-Systemen

von Lynn Reuss

Input

Die schon vorhandenen ingenieurbetriebenen Ansätze zur Programmierung zellulärer Funktionen gilt es intelligent einzusetzen, um langfristig neue Strategien für den Entwurf biologischer Schaltkreise zu entwickeln, wie z.B. die Weiterentwicklung synthetischer Genschaltkreise. Doch eine möglichst effiziente Methode zu konzipieren, mit welcher es möglich ist, komplexe metabolische Prozesse steuern zu können, stellt Wissenschaftler noch heute vor eine Herausforderung.

Genexpression und der genetische Schaltkreis

Der Vorgang, bei dem die genetische Information umgesetzt wird, heißt Genexpression. Diese Information steht in der DNA einer jeden Zelle – sie wird abgelesen, übersetzt und in ein Genprodukt umgewandelt.

Abb. 1: Elektronische Systeme in den biologischen Kontext setzen. Oben: Electronic System Block Diagramm (verändert nach Grout, I. [2008]). Die Signalverarbeitung steht für das System, welches die Information eines Eingangssignals verarbeitet und anschließend bearbeitet als Ausgangssignal wieder herausgibt. Unten: Im biologischen Kontext bedeutet dies, dass das signalverarbeitende System (in diesem Fall) die Genexpression ist. Diese wird aktiviert, sobald als Eingangssignal eine bestimmte RNA, die Input-RNA, vorhanden ist. Exprimiert wird GFP, Green Fluorescent Protein, ein grün fluoreszierendes Protein, das als Ausgangssignal dient. RBS – Ribosomale Bindungsstelle, GOI – Gene Of Interest.

Inspiriert von hochentwickelten DNA-Schaltkreisen und durch die Fortschritte in der synthetischen RNA Biologie ist es trotz allen Schwierigkeiten gelungen, die Genexpression mittels komplexer Ribocomputing-Systeme zu steuern. Die Entwicklung reiner RNA Schaltkreise in Bakterien ermöglicht die Durchführung von komplexen intrazellulären Funktionen in einer einzigen Schaltkreisschicht. Doch wie funktioniert das im Detail? Um diese Frage beantworten zu können, muss zuerst der Aufbau eines solchen Systems erklärt werden.

Aufbau von Ribocomputing-Systemen

Um einen genetischen Schaltkreis zu steuern, bedarf es eines Eingangssignals (Input), einer prozessierenden Einheit und eines Ausgangssignals (Output). Dabei setzen sich die Ribocomputing Systeme aus de novo, d.h. neu-designten biologischen „Bauteilen“ zusammen, welche nach den üblichen Basenpaarungsregeln und nach vorgeschriebenen Interaktionsregeln funktionieren.

Ein Netzwerk aus verschiedenen Ribonukleinsäure-Sequenzen (Input RNA) dient als Eingabesignal, d.h. als Input. Sie binden dabei an die prozessierende Einheit, können jedoch auch so modelliert werden, dass sie auch miteinander interagieren können, um z.B. komplexere Strukturen zu bilden.

Abb. 2: Mögliche Input-RNA. Farbe deutet auf unterschiedliche Sequenzen bzw. Sequenzabschnitte hin. Gleiche Farben können aneinander oder an die Sequenzabschnitte der Sensormodule binden (verändert nach Green et al.[2017]).

Die prozessierende Einheit ist das zentrale signalverarbeitende Element und wird als Gate-RNA bezeichnet. Es besteht aus diversen Sensormodulen mit einem zu exprimierenden Gen. Die Anzahl der Sensormodule kann je nach gewünschter Komplexität variieren, wobei die Module aus einem zur Input-RNA komplementären Bereich, einer ribosomalen Bindungsstelle (RBS) und dem Startcodon AUG bestehen und direkt „in Reihe“ geschaltet sein können (siehe Abb. 3).

Abb. 3: Gate-RNA bestehend aus unterschiedlich vielen Sensormodulen und einem zu exprimierenden Gen. Sensormodule besitzen eine typische Haarnadelstruktur. Die farbig markierten Bereiche sind Sequenzabschnitte, an denen die Input-RNA binden können. Die RBS befindet sich am oberen Ende der Haarnadelstruktur und ist als schwarze Strichlinie dargestellt. Das Startcodon AUG ist ebenfalls als kurze Strichlinie gekennzeichnet. Sowohl RBS als auch AUG stehen durch die Struktur der Sensormodule nicht für das Ribosom zur Verfügung. Das Output Gen ist den Sensormodulen nachgeschaltet und bei nicht vorhandener Input-RNA ausgeschaltet. (Green et al.[2017]).

Die Sensormodule stammen von neu entwickelten Toehold-Switches ab. Sie verhindern die Genexpression durch ihre besondere Struktur: die Hairpin-Struktur, die einer Haarnadel ähnelt. Dadurch kann das Ribosom nicht an der ribosomalen Bindungsstelle andocken, die Translation kann also nicht stattfinden – das Gen ist „ausgeschaltet“. Beim Toehold Switch kann das Gen nur dann „eingeschaltet“ werden, wenn eine sogenannte Trigger-RNA in der Zelle exprimiert wird, da diese an einem bestimmten Sequenzabschnitt der Haarnadelstruktur – der Toehold-Region – bindet, die Struktur auflöst und somit das Gen aktivieren. Gate-RNA können im Gegensatz zu Toehold-Switches wesentlich komplexer ausfallen durch unterschiedlich viele in Reihe geschaltete Sensormodule. Der Funktionsmechanismus sowie die besondere Struktur der Sensormodule bleiben jedoch ähnlich. Die Input RNA ist für die Gate-RNA dasselbe, wie die Trigger RNA für den Toehold-Switch.

Toehold

Toehold bedeutet zu Deutsch „Brückenkopf“. Der Begriff Brückenkopf bezeichnete ursprünglich eine Wehranlage, von welcher aus eine Brücke gegen feindliche Angriffe gesichert werden konnte. Heutzutage wird damit eher die Auffahrt auf eine Brücke bezeichnet – wie man in der Abbildung auch gut erkennen kann (Abb. 4).

Abb. 4: Toehold-Switch RNA-Sensor nachdem die Trigger-RNA an den komplementären Sequenzabschnitt des Sensormoduls gebunden hat (A an A*). Die Trigger-RNA besteht aus drei Abschnitten: roter Abschnitt u, hellblauer Abschnitt A und violetter Abschnitt v. Sequenzabschnitt u und Sequenzabschnitt v bilden die sogenannten Toeholds – die Trigger RNA erscheint wie eine Brücke. Die Haarnadelstruktur ist aufgelöst, das Ribosom kann an der ribosomalen Bindungsstelle binden und das Gen abgelesen werden (Green et al.[2017]).

Der Output ist bei „eingeschaltetem“ Gen ein fluoreszierendes Protein. Die Fluoreszenz kann bei der Auswertung gemessen werden, sodass festgestellt werden kann, ob die Genexpression stattgefunden hat und ob der Schaltkreis wie gewünscht funktioniert.

Besonderheiten der Input RNA

Mittels der Input-RNA und der Gate-RNA können nun biologische Funktionen gesteuert werden. Dabei kommt es im Wesentlichen darauf an, ob die verschiedenen Input-RNA miteinander agieren sollen oder nicht.

Wenn sie nicht miteinander interagieren, sondern unabhängig voneinander an den Sensormodulen der Gate-RNA binden und dadurch die Proteinproduktion auslösen, bezeichnet man dies als ODER-Schaltung. Dieser Begriff stammt von elektrischen Schaltkreisen und wird auch als ODER-logische Operation oder (aus dem Englisch entlehnt) als OR Logik bezeichnet. Dabei muss mindestens eine von unterschiedlich vielen Input-RNA vorhanden sein, um an ein Sensormodul binden zu können. Sobald die Haarnadelstruktur aufgelöst ist, kann das Ribosom an der RBS binden und mit der Translation beginnen. Der Clou hierbei: Das Ribosom kann durch die Gate-RNA scannen und alle nachgeschalteten Sensormodule abwickeln – die Haarnadel-Sensormodule ohne an sie gebundene Input-RNA behindern also nicht die Genexpression!

Abb. 5: OR-Logik. Vier verschiedene Input-RNA. Die Farbgebung zeigt an, dass die Sequenzen unterschiedlich sind und somit komplementär an nur ein Sensormodul binden (Green et al.[2017]).

Interagieren verschiedene Input-RNA miteinander, d.h. binden sie aneinander, so gibt es zwei Möglichkeiten:

  1. Gehen Sie eine Kooperation ein, um an ein Sensormodul der Gate-RNA zu binden, so bezeichnet man dies als UND Schaltung, auch UND-logische Operation oder (aus dem Englischen) AND-Logik. Es binden hierbei zwei oder mehr Input-RNA über komplementäre Sequenzabschnitte (in Abbildung 6 in denselben Farben dargestellt). Erst nachdem die verschiedenen Input-RNA einen Komplex eingegangen sind, kann dieser an ein Sensormodul der Gate-RNA binden. Dies bedeutet, dass eine einzelne Input-RNA nicht zur Auslösung der Genexpression führen kann, sondern – je nach Modellierung – zwei oder mehr Input-RNA vorliegen müssen.
Abb. 6: AND-Logik. Vier verschiedene Input RNA. Diesselben Farben zeigen an, dass diese Sequenzbereiche komplementär zueinander sind, sodass sie eine Bindung eingehen können (Green et al.[2017]).
  1. Binden zwei Input-RNA aneinander, ohne danach eine Bindung mit der Gate-RNA einzugehen, so wird hier von einer Inhibierung gesprochen. Dies bedeutet, dass eine dieser zwei Input-RNA verhindert, dass die andere Input-RNA an das Sensormodul der Gate-RNA binden kann. Infolgedessen kann es nicht zur Proteinproduktion kommen, da die translationsunterdrückende Struktur der Sensormodule nicht aufgelöst werden kann und das Gen „ausgeschaltet“ bleibt. Man bezeichnet dies daher als NICHT-Logik bzw. NOT-Logik.
Abb. 7: NOT-Logik. Direkte Hybridisierung der deaktivierenden RNA (links unten: gestrichelter Pfeil) an die Input RNA (Pfeil rechts oben) verhindert die Genexpression. Die Input-RNA kann gebunden nicht an die Gate-RNA binden (Green et al.[2017]).

Kombination zu komplexen Systemen

In der synthetischen Biologie ist es nun möglich durch Kombination von OR-, AND- und NOT-Logik komplexe Systeme aufzubauen. Eine Verknüpfung von mehreren AND-Logik-Schaltern oder mehreren OR Logik Schaltern folgt dabei den eben beschriebenen Prinzipien: Bei der AND Logik müssen zwei oder mehr Input-RNA hybridisieren und bei OR-Logik muss eine von mehreren Input-RNA bei entsprechender Anzahl an Sensormodulen in der Gate-RNA vorhanden sein, um den Vorgang der Genexpression zu aktivieren. Bei beiden wurde getestet, ob das gesamte Ribocomputing System stabil bleibt, je mehr Sensormodule in der Gate-RNA eingebaut sind und dementsprechend mehr Input-RNA benötigt wird – Stück für Stück wurde die Anzahl beider Komponenten erhöht und es konnten deutlich bessere Ergebnisse bei der AND-Logik erzielt werden als bei der Vorgängerversion der Toehold-Switches. Bis zu vier verschiedene eingebaute Sensormodule mit den entsprechenden Input-RNA lieferten positive Ergebnisse. Als vorteilhaft hierbei erwies sich auch, dass dieses 4-Input-System genetisch kompakt ist.

Bei der OR-Logik bestand das komplexeste getestete System, welches positive Ergebnisse lieferte, aus insgesamt sechs in Reihe geschalteten Sensormodulen.

Es ist jedoch auch möglich unterschiedliche Logikoperatoren miteinander zu verknüpfen. Das komplexeste getestete System ist ein 12-Input-RNA-Ribocomputing System bestehend aus miteinander gekoppelten AND-, OR- und NOT-Logiken, welches in vivo robust funktioniert.

12-Input Ausdruck

(A1 AND A2 AND NOT A1*) OR (B1 AND B2 AND NOT B2*) OR (C1 AND C2) OR (D1 AND D2) OR (E1 AND E2)

Abb. 8: Komplexer 12-Input-Ausdruck. Die 12 Input-RNA (oben) bestehen je nach Kategorie (A-E) aus hybridisierbaren Teilsequenzen nach dem Prinzip der AND-Logik. So entstehen aus den 12 Input-RNA fünf hybridisierte RNA-Komplexe (mittig), welche an der Gate-RNA binden können. Diese besteht aus fünf Sensormodulen und einem Output Gen. Mindestens ein Sensormodul muss an ein Input-RNA-Komplex binden, damit das Ribosom binden kann – nach dem Prinzip der OR-Logik (Green et al. [2017]).

Output

Die Herausforderung synthetisch hergestellte biologische Bauteile in Verbindung mit den in der booleschen Algebra geltenden Regeln in ein Ribocomputing-System zu überführen scheint also auch für komplexe einschichtige Genschaltkreise in der heutigen Zeit möglich. Vorteilhaft erweist sich die Verwendung von einfachen wenig komplexen Komponenten, wie z.B. der RNA. Sowohl die Input RNA als auch die Gate-RNA können im Labor konstruiert werden und in einen Organismus eingebracht werden, wodurch sich biologische Funktionen wie die Aktivierung oder Inhibierung von Genen steuern lassen. Dabei bietet RNA ein breites Spektrum an Möglichkeiten zur Konstruktion von einschichtigen Schaltkreisen: zwischen zwei bis 12 Inputs und ebenso viele Sensormodule in der Gate-RNA. Anwendung findet dies zum Beispiel in der Medizin: Programmierte Biomoleküle können eine günstige Alternative bei der Erkennung von Krankheitserregern sein – und durch die Verwendung von RNA könnten Ribocomputing-Systeme nicht nur in Bakterien, sondern auch in Eukaryonten funktionieren.

Verwendete Literatur

    • Green, A. A. et al. (2017): Complex Cellular Logic Computation using Ribocomputing Devices, Macmillan Publishers Limited (Springer Nature). doi:10.1038/nature23271
    • Grout, I. (2008): Digital Systems Design with FPGAs and CPLDs, Elsevier Ltd. All, 217-331. doi:10.1016/b978-0-7506-8397-5.00005-2
    • James, M. (2019): The Programmer’s Guide To Theory - Great ideas explained, IO Press. 214 Seiten. ISBN-13: 978-1871962437
    • Wynn, M. L., Consul, N., Merajver, S. D., & Schnell, S. (2012). Logic-based models in systems biology: a predictive and parameter-free network analysis method. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro, 4(11), 1323–1337. https://doi.org/10.1039/c2ib20193c

Zusätzliche Literatur

    • Ameruoso, A., Gambill, L., Liu, B., Villegas Kcam, M. C., & Chappell, J. (2019): Brave new “RNA” world - Advances in RNA tools and their application for understanding and engineering biological systems. Current Opinion in Systems Biology. doi: 10.1016/j.coisb.2019.02.005
    • Benenson, Y. (2009): Biocomputers – from test tubes to live cells. Molecular BioSystems, 5(7), 675. doi: 10.1039/b902484k
    • Bhatia, S., & Densmore, D. (2013). Pigeon: A Design Visualizer for Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology, 2(6), 348–350. doi: 10.1021/sb400024s
    • Densmore, D. (2012): Bio-Design Automation: Nobody Said It Would Be Easy. ACS Synthetic Biology, 1(8), 296–296. doi: 10.1021/sb300062c
    • Densmore D. and Anderson J. C. (2009): Combinational logic design in Synthetic Biology, in Circuits and Systems, ISCAS. IEEE International Symposium, 301-304. doi: 10.1109/ISCAS.2009.5117745
    • Moe-Behrens, Gerd H.G. (2013): The Biological Microprocessor, or how to build a computer with biological parts, in: CSBJ, Vol. 7, Issue 8. doi: 10.5936/csbj.201304003

Internetquellen und Videos