Engineering Complex Synthetic Transcriptional Programs with CRISPR RNA Scaffolds

von Philipp Vierig

Einleitung

Die Nutzung und Manipulation von Stoffwechselwegen in Organismen ist ein großes Teilgebiet der Synthetischen Biologie. Dieser Biotechnolgiezweig befasst sich nicht nur mit Grundlagenforschung im Bereich Metabolismus sonder auch mit anwendungsbezogenen Beispielen für industrielen Nutzen. Ziel der derzeitigen Forschung ist es ein Genregelierungssystem zu entwickeln, welches viele Genorte „Loci“ gleichzeitig anspricht aber bei jedem eine unterschiedliche Art der Regulierung hervorruft. Ein Lösungsansatz könnten dabei Genregulierungsnetzwerke zum Beispiel Zinkfinger oder Transkriptionsaktivator-ähnliche [TAL]-Effektoren darstellen. Diese sind in der Lage ein Genom auf zahlreiche, unterschiedliche Art und Weisen zu interpretieren und die Information über multilokale oder multidirektionale Signalweiterleitungen an Regulatoren wie zum Beispiel Transkriptionsaktivatoren und Repressoren zu vermitteln. Ein vielversprechendes Genregulierungsnetzwerk, welches auf Basis von CRISPR RNA als Gerüstmolekül „Scaffolds“ aufgebaut ist, wurde in einen Wissenschaftsartikel unter dem Namen „Engineering Complex Synthetic Transcriptional Programs with CRISPR RNA Scaffolds“ im Januar 2015 von Jesse G. Zalatan et al publiziert, siehe Abbildung 1. [Jesse G 2015]

Die nachfolgenden Absätze beschäftigen sich mit dem Aufbau des CRISPR RNA Scaffolds, mit den Bestandteilen des Genexpressionsnetzwerkes sowie dessen Anwendungsmöglichkeiten.

CRISPR/Cas-System

In der Publikation von der Biochemikerin Jennifer Doudna und der Mikrobiologin Emmanuelle Charpentier wurde ein Verfahren namens „CRISPR/CasSystem“ vorgestellt, welches in der Lage ist, im Genom nukleotidgenaue Veränderungen vorzunehmen. CRISPR steht für „clustered regularly interspaced short palindromic repeats“ und Cas für „CRISPR-assoziierte Gene“. Das Prinzip von CRISPR/Cas ist wie folgt:

Eine Zielsequenz (welche als Spacer bezeichnet wird) mit einer Basenlänge von ca. 20bp wird zwischen zwei auf dem Genom befindlichen Repeats ligiert. Somit ist folgender Genabschnitt gegeben: Am Anfang des CRISPR-Locus befindet sich die tracrRNA (transactivating crRNA), darauf folgt der Genabschnitt, der für Cas9 codiert, kurz danach befindet sich die Leader-Sequenz mit anschließenden Repeat- und Spacer-Sequenzen. Wird der CRISPR-Lokus durch eine DNA-Polymerase assembliert, werden von jedem Spacer crRNAs (CRISPR-RNA-Moleküle) gebildet. Im ersten Schritt werden crRNA und tracrRNA über einen zwei Basenpaar großen RNA-Linker miteinander verknüpft. Dieser cr/tracrRNA-Hybrid (sgRNA = single guide RNA) bildet zusammen mit der Cas9-Endonuklease im zweiten Schritt einen gemeinsamen Komplex. Der CRISPR/CasKomplex sucht das komplette Genom nach der komplementären Sequenz zur Zielsequenz ab und schneidet diese. Schematisch ist dies in Abbildung 2 zusehen. [Wünschiers 2019]

Genregulierungsnetzwerk

Eine Methode zur nukleotidgenauen Erkennung von Sequenzabschnitten ist hervorragend geeignet für den Gebrauch in ein Genregulierungsnetzwerk. Da somit fehl regulatorisches eingreifen vermieten werden kann. Für die tatsächliche Anwendung muss die Endonukleoaseaktivität der Cas9-Endonuklease ausgeschalten werden, damit die Regulatorischezielsequenz nicht zerschnitten werden kann. Das entstandene Enzym dCas9 „dead Cas9“ besitzt keine Enzymaktivität und lagert sich an die Zielsequenz an.

Das Genregulierungsnetzwerk auf Basis von CRISPR RNA Scaffolds besteht aus drei Hauptkomponenten. Das Gerüst und damit der erste Bestandteil stellt der Master Regulator dar. In dem Genregulierungsnetzwerk auf Basis von CRISPR RNA übernimmt diese Aufgabe das dCas9, siehe Abbildung 3.

Es ist verantwortlich für die Informationsweitergabe, leitet also die empfangenen Signale an den Regulator weiter. Desweitern stabilisiert das Enzym den gesamten Komplex und entfaltet die doppelsträngige DNA damit Genexpression und Genregulation ablaufen können. Den zweiten Bestandteil des Genregulierungsnetzwerkes stellen variable RNA Scaffolds dar. Sie dienen als Gerüstmolekül und verbinden crRNA mit RNA Bindungsdomänen. Die RNA Scaffolds beeinflussen mit ihrem Strukturelenaufbau und Bindungsmöglichkeiten wie viele RNA Bindungsdomänen an das Genregulierungsnetzwerk binden können. Somit regulieren sie die Stärke der Genregulation. Das bedeutet es gibt RNA Scaffolds, welche ein oder zwei RNA Bindungsmöglichkeiten aufweisen. Beispiele dafür sind zu einem, der RNA Scaffold „MS2“ mit zwei Bindungsmöglichkeiten für das Protein „MCP“ und der RNA Scaffold „com“ mit einer Bindungsmöglichkeiten für das Protein „Com“, siehe Abbildung 4.

Die Effectorproteine stellen den dritten Bestandteil dar. Sie sind für die Art der Regulation des Zielgens verantwortlich, ob zum Beispiel die Genexpression des Ziel Locis verstärkt oder gehemmt werden soll. Dafür wurden die Effectorproteine an die RNA Bindungsdomänen synthetisiert um so direkten Einfluss am Reaktionsort zu haben, siehe Abbildung 5.

Das Genregulierungsnetzwerk kann sich in der Zelle wie folgt zusammenlagern. Die Information für die Synthese der Komponenten (dCas9, RNA Scaffolds, Effector Proteine) des Genregulierungsnetzwerk befinden sich auf dem Promotor des zu regulierenden Zielgens. Der Komplex kann sich direkt zusammenlagern mit dem Operator des zu regulierenden Zielgens interagieren. Der Aufbau, wie sich die Bestandteile des Genregulierungsnetzwerk in welcher Abfolge aneinander Lagern, wurde oft variiert und optimiert. Zum einem wurde Linkerbasenlänge zwischen sgRNA und Scaffold RNA-Konstrukt auf zwei Basenlängen reduziert, da längere Linker zu einem Stabilitätsverlust und somit zu einer schwächeren Reportergenexpression führten. Zum anderem wurden das Scaffold RNA-Konstrukt am 3´Ende der sgRNA synthetisiert, da es am 5´Ende der sgRNA zu keiner signifikanten Reportergenexpression kam. Desweiteren wurde die Reportergenexpression gesteigert, indem wiederholende Scaffold RNA-Konstrukte hintereinander vernetz wurden. Das Konstrukt wird über ein doppelsträngigen Linker stabilisiert. Somit kommt es zur stärkeren Reportergen Aktivierung im Vergleich zu den analogen Einzelhairpin-scRNAs. Die Reportergenexpression kann weiter gesteigert werden indem ein gemischtes Hairpinkonstrukt verwendet wird, zum Beispiel ein Hairpinkonstrukt aus MS2- und Aptamer Hairpin (f6), siehe Abbildung 6.

Somit ist die Möglichkeit gegeben das unterschiedliche RNA-binde Proteine mit der Selle des Sametargets interagieren können. Es bietet dadurch einem effektiven Ansatz um kombinatorisch mehrere Effektoren für die Kontrolle von Zielgenen zu nutzen.

Die Genregulierungsnetzwerke können nicht nur eine verstärkte Genexpression hervorrufen, sondern auch eine hemmende Wirkung zeigen. Genau wie bei Genregulierungsnetzwerke welche die Genexpression steigern, gibt es Effectorproteine, zum Beispiel KRAB „Krüppel associated box“, welche die Genexpression senken oder verhindern. Hierbei gibt es jedoch einen kleinen Unterschied bei der Anwendung von Genregulierungsnetzwerken zwischen Prokaryoten und Eukaryoten. In Prokaryoten reicht die Anlagerung von dCas9 an den Zielloci aus um die Genexpression zu verhindern. Man spricht dabei von Blockierung durch Anlagerung. Bei Eukaryoten müssen jedoch Genbreiche stärker verändert werden, um eine hemmende Wirkung zu erzielen. Hierbei reicht eine Blockierung durch Anlagerung nicht aus, sondern das Genregulierungsnetzwerk muss zu einer Konformationsänderung führen. Das bedeutet KRAB bewirkt bei Anlagerung an den Zielloci, dass dieser Genbereich stärker um Histone gebunden ist und somit die DNA-Polymerase nicht in der Lage ist das Gen abzulesen. Die Hemmwirkung kann wie bei der verstärkten Genexpression durch Genregulierungsnetzwerke mit Scaffold RNA-Konstrukten variiert werden.

Zusammenfassung

CRISPR ist ein raffinierter und erfolgsversprechender Komplex, mit dem in der Genregulierung, als Schlüsselkomponent in Genregulierungsnetzwerk, viel erreicht werden kann. Mit diesem Werkzeug ist nicht nur eine Überexpression oder eine komplette Stilllegung eines Genbereiches möglich, sondern auch eine gezielte down-und up-Regelung siehe Abbildung 7.

Literaturverzeichnis

• • Wünschiers R. (2019). Generation Genschere, 1. Aufl., Springer Verlag, S. 160-176
  • Jesse G. Zalatan, Michael E. Lee, Ricardo Almeida, Luke A. Gilbert, Evan H. Whitehead, Marie La Russa, Jordan C. Tsai, Jonathan S. Weissman, John E. Dueber, Lei S. Qi, Wendell A. Lim, 2015, Engineering Complex Synthetic Transcriptional Programs with CRISPR RNA Scaffolds