Die Synthetische Biologie - Ein Toolkit für Hefen

von Joe Fischer

Um sich an das Thema der synthetischen Biologie oder der Biotechnologie im Allgemeinen etwas heranzutasten, empfiehlt es sich Beispiele zu betrachten, die uns ständig umgeben und die wir ständig gebrauchen. Schon die alten Ägypter machten sich unbewusst, biotechnologische Methoden zu Nutze, in dem sie die Gärungsmechanismen der Hefepilze nutzten, um Bier und Wein herzustellen (Khaderi 2019).

In der heutigen Zeit benötigt man Hefe in recht großen Mengen, um die Nachfrage nach Bier, Wein und anderen Anwendungsbereichen in der Lebensmittelindustrie zu befriedigen. Dieser Fermentationsprozess von Hefen wird deshalb optimiert, indem mit Hilfe gentechnischer Methoden, gezielte Veränderungen im Genom von verschiedenen Hefearten, wie der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae oder der Weinhefe Kloeckera apiculata vorgenommen werden. Auch die Robustheit der Hefen kann durch Genomeditierungen optimiert werden (Jagtap et al. 2017).

Die synthetische Biologie geht dabei noch einen Schritt weiter. Das Ziel in der synthetischen Biologie ist es völlig neue Funktionen in Zellen zu etablieren (Lee et al. 2015). Dafür muss man sich das Genom einer Hefe als eine Art Baukasten oder Toolkit vorstellen. In diesem Toolkit befinden sich verschiedene essenzielle Parts, also Teile, die man individuell zusammensetzen kann, (siehe Abb. 1).

Aus diesen genetischen Einzelteilen können so komplexe Kassetten zusammengebaut werden, die dann in der Zelle eine neue Funktion erfüllen. Um beim Eingangsbeispiel zu bleiben, ergaben Versuche, eine neue bzw. de novo Hefezelllinie, die in der Lage ist, Himbeeraroma, während des Gärprozesses zu produzieren. Dafür wurde eine Plasmid Kassette in Hefezellen eingeschleust, mit der codierenden Sequenz zur Herstellung des Stoffes 4-[4-hydroxyphenyl]butan-2-on, bei welchem es sich um das Himbeeraroma handelt (Jagtap et al. 2017). Auch für andere Anwendungsbereiche, wie zum Beispiel für den Medikamententransport im Menschen, werden synthetisch veränderte Hefen immer häufiger eingesetzt (Sabu et al. 2019).

Doch warum eignen sich gerade Hefen so gut für die Anwendung in der synthetischen Biologie?

Vorteile von Hefen

Das Problem der synthetischen Biologie ist die Komplexität der Zelle. Deshalb muss man die komplexen Strukturen zu Komponenten mit vorhersehbaren Reaktionen aufschlüsseln, wie bereits in Abb. 1 gezeigt wurde. Die Hefe ist ein wichtiges Chassis oder eine wichtige Wirtszelle für die synthetische Biologie, da es wichtige molekulargenetische Werkzeuge enthält. Als Eukaryot ist die Hefezelle vom Genomaufbau und dessen Strukturierung, unseren Zellen ziemlich ähnlich. Hinzu kommt, dass die Hefe schon ein seit langem eingesetzter Modellorganismus ist, sowie bereits erklärt, schon sehr lange in der Industrie Verwendung findet. Daher ist die Hefe auch bestens erforscht und ihr Genom ist vollständig entschlüsselt, was die Identifizierung von Parts vereinfacht (Lee et al. 2015).

Für einen wahrscheinlich bekannteren Modellorganismus, wie Escherichia coli (E. coli) gibt es einen sehr großen Datensatz mit vielen bisher identifizierten Parts und deren Eigenschaften. Eingesetzt wird E. coli in großer Vielfalt in der Industrie zum Beispiel zur Herstellung verschiedenster Pharmaka, wie Insulin vor (Zieliński et al. 2019). Auch für Hefen gibt es eine solche Datenbank mit unterschiedlichsten Parts. Jedoch in weitaus kleinerer Form. Deswegen wird daran geforscht ein standardisiertes Toolkit für die Hefe zu entwickeln, um den Einsatz in der synthetischen Biologie zu erleichtern.

Das Mo-Clo System

Das Ziel des modularen Klonens oder des Mo-Clo Systems ist es multigene Plasmide (siehe Abb. 2) zu synthetisieren, die dann zur Ausprägung gewünschter Eigenschaften in meinem Organismus führen (Weber et al. 2011). Wie das Mo-Clo System im Detail funktioniert, lässt sich gut aus Abbildung 2 ableiten.

Zunächst ist aus PCR (Polymerasekettenreaktion), aus Synthese oder aus Isolation gewonnene DNA als Ausgangstoff vorhanden. Kehren wir zum Beispiel des Anfangs zurück, könnte es sich um synthetisierte DNA handeln, die die Information zur Bildung des Himbeeraromas enthält. Die dafür notwendigen Sequenzabschnitte müssen nun durch Restriktionsenzyme, also molekulare Scheren herausgeschnitten und wieder korrekt zusammengefügt bzw. assembliert werden.  Häufig wird für den Assemblierungsschritt, dass sogenannte Golden Gate Assembly verwendet, doch dazu später mehr.

Als Ergebnis erhalten wir nun die bereits bekannten Parts, also Nukleotidsequenzen mit definierter Funktion (Lee et al. 2015). Darunter zählen codierende Sequenzen, zum Beispiel das Gen für ein Enzym, welches dann unser Himbeeraroma synthetisiert. Zudem sind verschiedene DNA-Sequenzen vorhanden, die die Expressionsstärke beeinflussen. Promotoren und Terminatoren sind Sequenzen vor und nach Genen, die beeinflussen, wie oft oder wie schnell ein Gen exprimiert, also abgelesen und in mRNA umgesetzt wird, die dann zu einem Protein führen kann. So könnte Beispielsweise gesteuert werden, wie stark der spätere Wein nach Himbeeren schmecken soll. Hinzu kommen noch sogenannte Origins of Replication. Diese Sequenzen bilden den Startpunkt der Replikation, des später assemblierten Plasmiden. Sogenannte assembly connectors sind Verbindungsstücke, die eingesetzt werden, um die Kassetten zu verknüpfen und Plasmid Übergänge multigener Plasmide zu ermöglichen.

Die einzelnen Parts werden anschließend zu vollständigen Plasmid Kassetten zusammengesetzt. Ein solcher Plasmid, der letztlich nur ein zirkuläres DNA-Molekül bildet, könnte in einen Organismus übertragen werden, um eine neue Eigenschaft hinzuzufügen. Doch eine Eigenschaft reicht meist nicht immer aus. Ein Himbeeraroma im Wein ist ja schön und gut, aber was ist Beispielsweise mit der Farbe des Weins oder mit dem Alkoholgehalt. Um all diese Eigenschaften auf einen Organismus, wie der Hefe zu übertragen, nutzt man einen multigenen Plasmiden. Es werden also alle gewünschten Eigenschaften mit verschiedenen Parts zusammengebaut, ähnlich dem Prinzip von Lego. Das Ergebnis ist ein multigener Plasmid der alle meine neuen, gewünschten Eigenschaften enthält und nur noch in den Organismus eingebracht werden muss.

Das Golden Gate Assembly

Voraussetzung für das Mo-Clo System, ist das Golden Gate Assembly. Dieses auf Restriktionsenzymen basierte Verfahren setzt viele verschiedene einzelne Parts und Plasmide höchst individuell innerhalb eines Klonierungsschritts zusammen (Engler und Marillonnet 2014) (siehe Abb. 3).

Um das Golden Gate Assembly zu verstehen, muss zunächst erklärt werden, wie die Restriktionsenzyme funktionieren. Diese bereits angedeuteten molekularen Scheren sind extrem wichtig, um zielgenau Parts auszuschneiden. Für einen Schnitt der DNA benötigen Restriktionsenzyme eine bestimmte Erkennungssequenz oder im englischen Recognition site, die in Abbildung 3 orange markiert ist. Die Restriktionsenzyme, die für das Golden Gate Assembly am besten geeignet sind, erkennen eine spezifische DNA-Sequenz und schneiden dann außerhalb dieser Recognition site, in dem grün markierten Bereich, indem auch das Part liegt. Dabei entstehen sogenannte sticky ends oder klebrige Enden. Dabei handelt es sich um die grünen einzelsträngigen Überhänge, die später die Ligation, also das zusammenbringen der verschiedenen Parts erleichtern (Prielhofer et al. 2017).

Wurde nun ein Part mit seinen sticky ends ausgeschnitten, so hat dieser nun zwei Möglichkeiten. Zum einen kann das grüne DNA-Fragment erneut mit seinen Ursprungssequenzen assemblieren, wodurch es jedoch auch wieder seine spezifischen Restriktionsenzyms Erkennungsdomänen erhält. Da die Schritte der Ligation und der Behandlung mit den Restriktionsenzymen mehrfach ausgeführt werden, würde der religierte Part, welches sich zu seiner Ursprungssequenz zusammengesetzt hat wieder und wieder geschnitten werden. Es sei denn das Part wird wie gewünscht in den blauen Sequenzrahmen eingefasst, der die Zusammensetzung mehrerer Parts zu einem Plasmid zeigt. Denn in dieser blauen Sequenz, sind die ursprünglichen Recognition sites der Restriktionsenzyme verschwunden und das Part kann nicht erneut ausgeschnitten werden. So kann nun innerhalb eines Reaktionsschrittes Stück für Stück ein Part an das andere gesetzt werden, bis ein vollständiger Plasmid assembliert wurde (Ellis et al. 2011).

Vorteilhaft ist vor allem, die Geschwindigkeit und die Präzision dieser Methode. Auch die Fehlerquote des Golden Gate Assemblies ist verschwindend gering, da die Parts solange ausgeschnitten werden, bis diese an der gewünschten Plasmidstelle zusammengesetzt wurden (Lee et al. 2015). 

Charakterisierung der Promotoren

Wie schon erwähnt handelt es sich bei Promotoren, um Sequenzen vor Genen, die die Expression von Genen stark beeinflussen können. Um ein Toolkit für Hefezellen zu erstellen, müssen zunächst alle verwendeten Parts charakterisiert werden, so auch die Promotoren. In (Lee et al. 2015) wurde dafür die Stärke von 23 Promotoren auf Basis von Genexpressionstests ermittelt. Dafür nutzte man Fluoreszenzgene und kombinierte so jeden Promotor mit den eingesetzten mRuby2 und dem Venus Fluoreszenzgen. Wird in einer Zelle das eingebaute Fluoreszenzgen abgelesen, so korreliert die Fluoreszenzstärke mit der Stärke des vor dem Gen geschalteten Promotors. Oder um es einfacher auszudrücken: ist nur eine schwache Fluoreszenz der eingesetzten Zellen zu messen, so kann man davon ausgehen, dass es sich auch bei dem eingesetzten Promotor um einen schwachen Promotor handelt, der nur eine geringe Genexpression gewährleistet.

Anhand dieser Tests wurden die Promotoren charakterisiert und ähnlich wie in Abbildung 4 ihrer Stärke nach aufgelistet. Daraus kann man nun ableiten, dass es sich Beispielsweise bei dem Promotor pTDH3 um einen sehr starken Promotor handelt. Reflektiert man nun diese Erkenntnisse auf das Anfangsbeispiel, so würde das folgendes bedeuten. Wird der Promotor pREV1 mit dem Himbeeraromagen kombiniert, so hätte das eine nur sehr schwache Expression des Gens und damit verbunden einen sehr schwachen Himbeergeschmack des Weins zu bedeuten.

Promotoren sind jedoch nicht die einzigen Regelmechanismen der Genexpression. Wie schon erwähnt gehören auch Terminatoren dazu, bei denen es sich um regulatorische Sequenzen handelt, die sich hinter bzw. die sich Genabwärts befinden. Terminatoren sind in der Lage, ebenfalls abhängig von ihrer Stärke, die Expression abzubrechen. Da Terminatoren ähnlich den Promotoren sind, wurde dasselbe Fluoreszenzexperiment auf verschiedene Terminatoren angewendet, um deren Stärke zu ermitteln. Auch wurden Versuche in Kombination mit verschiedenen Promotoren durchgeführt. Kombinierte man einen starken Promotor, wie pTDH3 mit einem starken Terminator, wie tENO1, so zeigte sich ein schwächeres Fluoreszenzsignal, verglichen mit der Kombination eines schwachen Terminators, wie tTDH1 (Lee et al. 2015).

Protein Degradation Tags

Nicht nur auf genetischer Ebene kann man die Produktion eines bestimmten Stoffes regulieren. Auch auf der eigentlichen Proteinebene ist ein nachträgliches Eingreifen, zur Kontrolle der Proteinkonzentration möglich. Um dies zu verstehen, werden jedoch noch ein paar mehr Grundlagen benötigt. Wie bereits bekannt ist haben wir eine bestimmte Gensequenz, die die Information zum Beispiel für die Expression eines Enzyms zur Herstellung von Himbeeraroma enthält. Ob und wie oft das Gen exprimiert wird hängt von regulatorischen Sequenzen, wie Promotor und Terminator ab. Über Transkription und Translation wird diese DNA-Information in eine Peptidkette übersetzt, die sich dann in die endgültige Form eines aktiven Enzyms faltet. Diese Peptidketten werden jedoch häufig in verschiedenen Kompartimenten der Zelle, wie dem Endoplasmatischen Retikulum umgebaut, verändert oder auch abgebaut. Schuld an dem Abbau sind unter anderem Ubiquitinierungen, die man sich auch in dem Toolkit für Hefe zu Nutze machen kann (Pedrazzini und Vitale 2018).

Wie (Lee et al. 2015) dies in Experimenten zeigen konnte gibt es auch bei sogenannten Ubi-Tags Unterschiede, die die Stärke des Abbaus bzw. der Degradation von Proteinen beeinflusst. Diese Tags werden zunächst als DNA-Sequenz vor das eigentliche Gen geschalten. Angenommen man möchte einen sehr schwachen Alkoholgehalt des Weins. Das Gen ADH1 in der Weinhefe Kloeckera apiculata ist für die Umwandlung von Acetylaldehyd in Ethanol zuständig (Frauke Julia Bink 2010). Wurde schon ein schwacher Promotor und ein starker Terminator eingesetzt, kann zusätzlich vor das ADH1 Gen eine Ubi-Tag Sequenz eingebaut werden. Es wird zwischen Ubi-R, Ubi-M und Ubi-Y Tag unterschieden. Der Ubi-R Tag wird nach der Translation am N-Terminus der Alkoholdehydrogenase, dem Protein des ADH1 Gens, gehängt. Ubi-R sorgt jedoch dafür, dass Proteasen angelockt werden, deren Aufgabe es ist Proteine im Körper abzubauen. Ein Ubi-R Tag sorgt für eine besonders starke Proteindegradation, während ein Ubi-M Tag für einen eher schwachen Proteinabbau sorgen würde. Soll also der hergestellte Ethanolgehalt verringert werden, so muss ein Ubi-R Tag eingesetzt werden, um die Alkoholdehydrogenase in großen Mengen abbauen zu lassen.

Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass die Effektivität der Ubiquitinierungen, im Verhältnis mit der Gesamtmenge an Protein zu sehen ist (Abb.5). Bei einem starken Promotor, bei dem Gene in hohem Maße exprimiert werden, zeigen die Ubiquitinierungen, links im Bild, sehr starke Auswirkungen. Wird jedoch ein schwacher Promotor genutzt, sind die Auswirkungen der Ubiquitinierungen, wahrscheinlich aufgrund der Gesamtkonzentration an Protein, geringer (Abb. 5 rechts) (Lee et al. 2015).

Einbringung der synthetischen DNA in die Zelle

Angenommen das synthetische DNA-Konstrukt wurde erstellt. Alle regulatorischen Elemente wurden nach Belieben und optimaler funktionsweise zugeordnet. Die letzte Herausforderung besteht nun darin, das genetische Konstrukt in die Zelle einzubringen. Häufig wurde von Plasmiden, also zirkulärer DNA gesprochen, da diese auch extrachromosomal also außerhalb der chromosomalen DNA von Hefezellen vorliegen können. Dadurch ist auch die Anzahl an Transformanden höher, da kein direkter Eingriff in das Genom der Hefezelle stattfindet. Als Transformanden werden die Zellen bezeichnet, die durch Transformation, Fremd-DNA in sich aufgenommen haben.

Die Einbringung eines Plasmiden in eine Zelle ist zwar leichter, doch die chromosomale Integration eines DNA Konstruktes ist stabiler (Lee et al. 2015). Eine Möglichkeit synthetische Konstrukte in die chromosomale DNA der Hefezelle zu integrieren, ist mittels Genscheren. Die Genschere CRISPR/Cas 9, die in den letzten Jahren für große Furore gesorgt hat, ist darauf spezialisiert präzise Schnitte im Genom zu tätigen. Man kann sich das Genom als eine Art Buch vorstellen. Die CRISPR-RNA von CRISPR/Cas 9 ist eine Art Suchmotiv. Sie enthält eine bestimmte RNA Sequenz, die komplementär zu der DNA-Sequenz im Genom ist, in der ich schneiden will. Dieses Suchmotiv führt die Cas 9 Nuklease, die eigentliche Schere, zu dem Ort im Genom, an dem sie schneiden soll. So können wie in einem Buch ganze Sätze ausgeschnitten werden oder eben Gene. Und in die entstandenen Lücken im Genom können andere Sequenzen wiedereingesetzt werden. Dieses ursprünglich aus Bakterien stammende System kann für das Hefe Toolkit genutzt werden, um synthetische DNA-Konstrukte chromosomal über Zellgenerationen hinweg stabil einzubauen.

Wie (Lee et al. 2015) in seiner Arbeit gezeigt hat (Abb. 6), eignet sich CRISPR/Cas 9 und die Endonuklease I-SceI sehr gut, um synthetische DNA Konstrukte in das Hefechromosom zu integrieren. Dafür wurden sogenannte Cutter Plasmide erstellt, welche die genetische Information zur Produktion der Genscheren CRISPR/Cas 9 und I-SceI enthielten. Wurden diese cutter Plasmide nun in die Zelle eingebracht, produzieren die Hefezellen selbständig die Genscheren, die dann im Hefegenom schneiden und das synthetische Genkonstrukt einfügen. So steigert sich die Transformationsrate um das Fünffache, verglichen mit dem unassistierten Einbringen von DNA ohne die Genscheren. Die Endonuklease I-SceI rechts im Bild übersteigt sogar, vor allen Dingen als linearisiertes Plasmid, die Transformationseffizienz, die mit einem einfachen Plasmid erreicht wurde.

Meine Eigenkonstruktion

Um zu zeigen, wie einfach synthetische Biologie sein kann, habe ich auf Grundlagen des standardisierten Toolkits von (Lee et al. 2015) in Abbildung 7, selbst einen synthetischen Plasmiden entworfen. Abbildung 8 zeigt eine mögliche Kombination verschiedener Parts, darunter auch die Gene für das Himbeeraromaenzym, ein Fluoreszenzgen als Marker und ein Gen zur erhöhten Ethanol Umwandlung. Zunächst ist der große orange Replikationsursprung der Hefe erkennbar. An dieser Stelle startet die Replikation bzw. die Vervielfältigung des Plasmids. Mittels den blau bis lila dargestellten Assemblierungs connectoren sind die einzelnen Plasmidkassetten miteinander verknüpft. Die erste Plasmidkassette besteht aus einem starken pTDH3 Promotor, einem Ubi-R Tag dem Gen für das Himbeeraromaenzym und einen schwächeren Terminator. Es würde also zu einer starken Expression des Himbeeraromagens kommen, dass Enzym würde jedoch auch durch den Ubi-R Tag stark abgebaut werden.

Die zweite Plasmidkassette exprimiert das Enzym welches Acetyylaldehyd in Ethanol umwandelt. Durch den starken pTDH3 Promotor und dem schwachen tTDH1 Terminator, wird das Enzym in großen Mengen exprimiert, was letztlich zu einem gesteigerten Alkoholgehalt führen würde.

Die letzte Plasmidkassette besteht aus einem schwachen pRev1 Promotor und einem starken tENO1 Terminator, die das Venus Fluorreszenzgen regulieren. Das Fluoreszenzgen wird also nur in sehr geringen Mengen exprimiert und soll eher als Marker für synthetische Hefezellen dienen. Das heißt möchte ich nach der Transformation wissen, welche Hefezellen das genetische Genkonstrukt enthalten, müssen nur diejenigen selektiert werden, die fluoreszieren.

So ist es doch erstaunlich wie einfach es ist mit Hilfe eines Toolkits synthetische Biologie zu betreiben. Organismen mit neuen Funktionen sind so vielfältig und optimierter in allen möglichen Zweigen der Industrie einsetzbar

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Literaturverzeichnis

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