Künstliche Lebensformen

von Robert Ziegenbalg

Einführung

Im Jahre 1818 wurde der Roman „Frankenstein“ von Mary Shelley veröffentlicht, in der ein Mann eine Kreatur künstlich erschuf. Was seit damals Vorlage für viele Geschichten und Filme war, ist teilweise über die Zeit wahr geworden – mit Hilfe der synthetischen Biologie. Die synthetische Biologie ist ein Bereich der Biologie, der sich damit beschäftigt, künstliche biologische Moleküle zu erschaffen oder sogar ganze künstliche Zellen, die nicht in der Natur vorkommen. Am J. Craig Venter Institute stellte man es zum ersten Mal im Jahre 2007 ein komplettes Bakteriengenom künstlich her. 2010 wurde bekanntgegeben, dass mit Hilfe des künstlichen Bakteriengenom ein synthetisches Bakterium erschaffen wurde, so gesehen in dieser Form, die erste künstliche Lebensform. Vorgestellt wurde diese Forschung in dem Paper „Creation of a Bacterial Cell controlled by a Chemically Synthesized Genome” [1]. Kurz zusammengefasst wird in diesem Paper erklärt, dass ein sequenziertes Genom am Computer modifiziert wurde, welches durch synthetische Oligonukleotide in viele DNA-Kassetten umgewandelt wurde. Diese DNA-Kassetten wurden mithilfe von Hefe zu einem kompletten Genom zusammengebaut. Dieses synthetische Genom wurde dann in eine Zelle übertragen, sodass diese Zelle dann nur noch durch das künstliche Genom kontrolliert wird. Aber warum sollte man überhaupt eine künstliche Lebensform erschaffen? Als Wissenschaftler ist es interessant zu wissen, ob bereits die Technologien vorhanden sind, um aus digitalen DNA-Sequenzen eine Lebensform zu erschaffen. Ziel des J. Craig Venter Institutes war es auch, mittels der Sequenzen einen Organismus zu erschaffen, der nur mit dem absolut notwendigen Genomgröße am Leben bleiben kann. Neben dem Forschungsdrang steht für eine private Firma auch möglicher Profit im Vordergrund. Als Firma, die zum ersten Mal eine künstliche Lebensform erschafft, kann man Patentrechte beantragen. Besonders für den privaten Sektor sind Patentrechte von großer Bedeutung. Denn durch diese besitzen Firmen technologische wie finanzielle Vorteile gegenüber anderen Firmen, die möglicherweise auf demselben technologischen Stand sind.

Die ersten Schritte

Bevor der synthetische Organismus erschaffen werden kann, mussten erst Versuche gemacht werden, um die beste Vorgehensweise festzustellen. Im Jahre 1995 wurde das Genom des Bakteriums Mycoplasma genitalium komplett sequenziert (Abb. 1). Mycoplasma genitalium besitzt das kleinste bekannte Genom. Es kann sogar noch weiter verkleinert werden.  Mehr als 100 der 485 Protein codierenden Gene können deletiert werden und der Organismus an sich wäre immer noch lebensfähig. Damit ist dieses Bakterium geeignet um ein Minimal-Genom zu erschaffen, welches alle lebensnotwendigen Proteine codiert. Für die Forschung zur Erstellung eines synthetischen Organismus interessant, ist er für den Menschen gefährlich. Als sexuell übertragbarer Organismus löst er Harnröhrenentzündung, bis hin zu Entzündungen des Gebärmutterhalses aus.

Das sequenzierte Genom von Mycoplasma genitalium wurde in 4 Stadien synthetisiert [2]. Beginnend mit chemisch hergestellten DNA-Kassetten mit einer Länge von 6 Kilobasen, wurden diese in der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, durch Kombination von enzymatischen Methoden und in-vitro Rekombination zu einem kompletten Genom zusammengefügt. Das synthetisch hergestellte Genom für Mycoplasma genitalium betrug in diesem Fall 582.970 Basenpaare Dieses wurde in eine Zelle ohne Genom übertragen. Das künstliche Genom übernimmt die Kontrolle über die Zelle. Wie bei Frankenstein wurde eine leere Hülle genommen, in diesem Fall die Zelle mit allen bereits vorhandenen Zellorganellen, welche durch ein künstliches Genom zum Leben erweckt wurde. Die Erschaffung eines künstlichen Lebens ist nicht einfach und benötigt die Überwindung vieler Hürden. Die erste Frage war, wie man das künstlich erschaffene Genom aus der Spender-Zelle in eine Akzeptor-Zelle übertragen kann. Kann die Akzeptor-Zelle dieses transplantierte Genom erkennen und die Proteine exprimieren?

Um die Versuchszeit zu verkürzen, nutzte man anstatt Mycoplasma genitalium die Bakterien Mycoplasma mycoides als Spender und Mycoplasma capricolum als Akzeptor. Diese Ersatzkulturen können einfacher kultiviert werden und wachsen schneller als Mycoplasma genitalium.  Die Spezies der Mycoplasmen besitzt keine Zellwände, was es einfacher macht, DNA in die Zelle zu integrieren. Durch die Abwesenheit von Zellwänden, sind die Bakterien vergleichbar mit Plasma Membranen von Eukaryoten. Diese Tatsache erlaubt es, dass Methoden zu DNA-Integration genutzt werden können, die bereits bei eukaryotischen Zellen genutzt werden [3].

Das synthetische Genom

Für die Erstellung des synthetischen Genoms wurde mit 2 Bakterienstämme gearbeitet, die im Labor erschaffen wurden [1]. Einmal mit einer Mycoplasma mycoides Subspezies namens capri (GM12). Das andere Genom entstammte dem modifizierten Hefe-Stamm YCpMmyc1.1-deltatypeIIIres. Dieser Stamm enthält ein transplantiertes Genom von M. mycoides. Um das synthetische Genom vergleichen zu können nutzte, man als Ausgangsgenom, das modifizierte Genom aus der modifizierten Hefe. Um das künstlich erschaffene Genom, JCVI-syn1.0, vom dem Ausgangsgenom, YCpMmyc1.1, unterscheiden zu können fügte man 4 Signalsequenzen hinzu, sogenannte „Watermarks“. Das sind künstliche Sequenzen, die im Ausgangsgenom nicht vorkommen und dazu dienen, dieses Genom als künstlich identifizieren zu können. Diese „Watermarks“ codieren einzigartige Proteine, die zum Detektieren genutzt werden können. Weiterhin unterscheidet sich das künstliche Genom an 19 anderen Stellen im Vergleich zum Ausgangsgenom. Mithilfe des sequenzierten Ausgangsgenom, das modifiziert wurde, erstellte man DNA-Kassetten, aus chemisch hergestellten Oligonukleotiden von einer Firma namens „Blue Heron Biotech“. Die DNA-Kassetten waren 1080 bp lang und besaßen 80 bp Überlappung mit der nächsten Kassette. Weiterhin enthielten sie eine Not I Restriktionsstelle an den Termini, damit sie besser in Hefe selektiert werden, sowie wachsen können. Doch wie wird aus 1072 Kassetten mit einer Länge von 1080 bp ein 1.077.947 bp großes Genom? Indem man in 4 Stadien aus den einzelnen DNA-Abschnitten immer größerer DNA-Fragmente erschafft, die schlussendlich das ganze Genom ergeben. Mithilfe der PCR wurde für jedes Assembly ein Vektor erschaffen. Diese Vektoren besaßen terminale Überlappungen für die Kassetten, sodass aufeinanderfolgende Kassetten miteinander kombiniert werden konnten. Im ersten Schritt wird aus den chemischen Oligonukleotiden 1080 bp lange DNA-Kassetten. Als nächstes wird ein 10 kbp großes Intermediat aus diesen erschaffen. Dafür nimmt man 10 Kassetten, die aufeinanderfolgen und einen Shuttlevektor, der sowohl in E. coli wie in Hefe eindringen kann. E. coli diente zur Überprüfung, ob die gewünschten Intermediate gebildet wurden. Dafür wurde das Intermediate in den Shuttlevektor in Saccharomyces cerevisiae rekombiniert und in E. coli transferiert (Abb.2).

Im Anschluss wurde die Plasmid-DNA von E. coli isoliert und überprüft, ob sich ein Vektor in E. coli befindet, der ein 10 kbp Insert enthält. Bei der Überprüfung stellte man fest, dass von zehn Hefeklonen einer das 10 kbp Fragment enthält und von 111 assemblierten Intermediaten 19 einen Fehler enthielten. Durch das Screening wurden die 19 fehlerhaften Kolonien entfernt und durch Klonen mit korrekt assembliertem Vektor ausgetauscht. Aus den 109 10 kbp Fragmenten wurden dann 11 100.000bp Intermediaten. Hierbei wurde vorgegangen wie bei den 10 kbp Intermediaten, wobei in diesem Fall die 10 kbp Intermediate mit ihren jeweiligen Vektoren in Hefe transformiert wurden, um daraus die 100 kbp Intermediate herzustellen. Diese Produkte konnten jedoch nicht stabil in E. coli transformiert werden [1].

Da diese Überprüfungsstrategie ein Limit von 10 kbp hatte, mussten die zukünftigen Produkte in Hefe mittels Multiplex Polymerase Ketten Reaktion überprüft werden. Eine Polymerase-Ketten Reaktion benötigt sogenannte Primer-Paare. Diese sind Sequenzen, die perfekt an Ausschnitten des 10 kbp Intermediate binden konnte und dafür sorgen können, dass die Sequenz die zwischen diesem Primern liegt, vervielfältigt werden kann. 25% und mehr der Klone besaßen das gewünschte 100 kbp Fragment. Am Ende besaß man nun 11 100 kbp, welche wiederum genutzt wurden, um das komplette Genom zu synthetisieren. Im letzten und finalen Schritt der Genom Konstruktion, wurden aus den 11 100 kbp Intermediaten ein komplettes Genom. Um dies zu erreichen, mussten jedoch größere Mengen von den 100 kbp Intermediaten produziert werden, um sicherzugehen das von allen 100 kbp Intermediaten genug vorhanden waren. Dafür mussten die 11 Intermediaten aufgereinigt werden, sie werden mit Hilfe von alkalischer Lyse, sowie von Exonukleasen behandelt und durch eine Anion-Austauschsäule laufen lassen. Dies, sowie ein Not I-Verdau wurden gemacht um lineare chromosomale Hefe-DNA zu entfernen, die die Transformation und Assembly Effizienz von Hefe verringert. Weiterhin wurde das Intermediat in Hefe Sphäroplasten transformiert [1].

Sphäroplasten sind Hefezellen, die durch Behandlung mit Enzymen ihre Zellwand verloren haben und so besser Fremd-DNA aufnehmen können [4].  Wie in den Schritten davor, wurden die 11 100kbp Intermediate in die Hefe transformiert, nur in diesem Fall ohne Vektor, da in dem Genomabschnitt 811-900 alle Elemente für das Klonen vorhanden waren. Zur Kontrolle, ob das vollständige Genom assembliert wurde, machte man eine Multiplex PCR mit 11 Primer-Paaren, eins für jedes der 11 100kbp Intermediate. Von 48 überprüften Kolonien hatte ein Klon die gewünschten 11 Amplicons. Für die weitere Überprüfung wurde das Genom mit Asc I und BssH II behandelt, zwei Restriktionsenzyme dessen Restriktionsseiten in 3 der 4 eingebrachten „Watermarks“ vorhanden war. Das durch die Restriktionsenzyme entstandene Restriktionsmuster, stimmte mit dem zu erwarteten Muster für das synthetische Genom über ein.

Transformation in Akzeptor Zelle

Um zu verstehen, wie es möglich ist, ein fremdes Genom in eine Zelle zu integrieren, muss man frühere Publikationen zu raten ziehen, die diese Mechanismen erklären [5]. Bei dem Versuch das in Hefe transferierte Genom auf M. capricolum zu übertragen, kam es zu Problemen. Es zeige sich das in M. capricolum eine Restriktionsendonuklease, welche DNA an bestimmten Stellen schneiden kann, dass synthetische Genom zerschneidet, da es unmethyliert ist. Mithilfe 2er Methoden sollte diese Barriere umgangen werden. In der ersten Methode deaktivierten sie die Restriktionsendonuklease in M. capricolum, um zu verhindern das die Endonuklease überhaupt eine Aktivität zeigt. Die andere Methode bestand darin, die DNA zu beschützen, bevor sie zerschnitten wird, indem sie methyliert wird. Für die schlussendliche Transformation des Genoms in M. capricolum, wurde M. capricolum ausgehungert, um zu verhindern, dass sie in der Zwischenzeit ihre eigene DNA replizieren [3]. Die M. capricolum Zellen wurden im Anschluss zusammen mit Hefe Transfer RNA in ein Medium transferiert, dass die extrahierte synthetische Genom DNA besaß. Nach einer weiteren Inkubationszeit wurde überprüft, ob sich das synthetische Genom in die Zelle integriert hat. Die auf diese Weise hergestellten Bakterien wurden auf SP4-Agar-Platten ausplattiert. Diese Platten beinhalten X-gal, die Zellen, die das synthetische Genom besitzen, haben das lacZ-Gen, wodurch sie β - Galactosidase bilden. Kommt die X-gal Komponente in Kontakt mit β-Galactosidase, färbt sich diese blau, wozu natürliche M. capricolum nicht in der Lage sind, sondern nur diejenigen, die das synthetische Genom besitzen. Für die Versuche mit dem synthetischen Genom, wurde zuvor das Genom aus M.capricolum entfernt [1].

Weiterhin wurde neben dem Phänotyp, auch der Genotyp der neuen Zelle untersucht. Das synthetische Genom besitzt vier „Watermarks“ anhand dessen dieses erkannt werden kann. Mithilfe von 4 spezifischen Primern genau für diese „Watermarks“ konnte mithilfe von Multiplex PCR gezeigt werden, dass das synthetische Genom in die Zelle integriert werden konnte. Weiterhin wurden das Genom mit Hilfe von Restriktionsenzymen, Asc I und BssH II, behandelt. Dabei zeigte sich wieder das zu erwartende Muster für das synthetische Genom. Es konnte auch gezeigt werden, dass das ursprüngliche Genom von M.  capricolum entfernt werden konnte und die Zelle nur noch von dem synthetischen Genom von M. mycoides JCVIsyn1.0 kontrolliert wird. Die Zellen, die das synthetische Genom besitzen, zeigten Selbstreplikation und logarithmischen Wachstum, dies zeigt das die Zellen mit dem synthetischen Genom lebensfähig sind.

Diskussion

Diese Experimente zeigten, dass es möglich war ein synthetisches Genom herzustellen, sowie dieses in eine Zelle zu transferieren, die dann nur noch von dem synthetischen Genom kontrolliert wird. Wie im Roman von Mary Shelly wurde eine neue Lebensform mit Wissenschaft und den Teilen einer anderen Lebensform zum Leben erweckt. Damit ist aber natürlich auch klar, dass dieser neue Organismus M. mycoides JCVI-syn1.0 nicht komplett synthetisch ist. Um lebensfähig sein zu können, benötigt das transferierte Genom eine bereits vorhandene Zelle, die alle benötigten Zellorganellen zur Verfügung stellt. Weiterhin besteht das synthetische Genom immer noch zu Großteilen aus den Originalsequenzen des Ursprungsgenom und wurde nur zur besseren Erkennung an gewissen Stellen modifiziert um es erkennbar zu trennen, vom Originalgenom. Dennoch sind diese gelungenen Experimente Meilensteine in der synthetischen Biologie. Mithilfe von am Computer erstellten Sequenzen konnten nach einem langen Wertegang ein funktionierender Organismus erschaffen werden, der nur noch von einem synthetischen Genom kontrolliert wird.

Mit dieser Technologie ist es möglich, neue synthetische Organismen zu erschaffen, die einzigartige Eigenschaften haben könnten. So könnten neue synthetische Organismen so produziert werden, dass sie in der Lage sind Biotreibstoff herzustellen oder auch dazu in der Lage sind, andere wichtige Biomoleküle herzustellen. Neben den möglichen Vorteilen muss sich immer gefragt werden, welche ethischen und moralische Konflikte entstehen durch das Erschaffen von synthetischen Organismen. Inwieweit darf der Mensch in die Natur eingreifen und manipulieren? Wenn solche synthetischen Organismen erschaffen werden, sind wir uns immer im Klaren welche möglichen Langzeitfolgen solche Forschungen haben. Was passiert, wenn einer dieser Organismen in die freie Natur kommt? Könnten dann diese Bakterien ihr künstliches Genom mit anderen teilen und dafür sorgen, dass die künstlichen Genabschnitte sich weiter in der Natur verbreiten? Diese Fragen dürfen nicht außer Acht gelassen werden, wenn in Laboren neue Lebensformen das Licht der Welt erblicken.

Quellen

1. 1. Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science (80- ) 2010;329:52–56.
   2. Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C, Denisova EA, Baden-Tillson H, et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome. Science (80- ) 2008;319:1215–1220.
   3. Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, Pieper R, Parmar PP, et al. Genome transplantation in bacteria: Changing one species to another. Science (80- ) 2007;317:632–638.
   4. Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, et al. Supporting-Information for Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science (80- ) 2010;329:52–56.
   5. Laitigue C, Vashee S, Algire MA, Chuang RY, Benders GA, et al. Creating bacterial strains from genomes that have been cloned and engineered in yeast. Science (80- ) 2009;325:1693–1696.