Die optimierte orthogonale Translation unnatürlicher Aminosäuren ermöglicht die spontane Doppelmarkierung von Proteinen & Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)

von Chantal Lange

Nachdem wir nun eine Einführung in das Thema Orthogonale Systeme erhalten haben, blicken wir etwas tiefer in die Materie. Dazu wollen wir uns anschauen, inwieweit eine optimierte orthogonale Translation von unnatürlichen Aminosäuren eine spontane Doppelmarkierung von Proteinen ermöglicht und in diesem Zusammenhang die FRET-Methode genauer beleuchten. Aber halt: Translation, Doppelmarkierung, FRET? Was ist das denn bitte? Was für den Leser, der nicht aus dem biologischen Fachbereich kommt, erst einmal etwas nach einer Fremdsprache klingt, ist gar nicht so kompliziert wie es auf den ersten Blick eventuell scheint.

Translation

Um das große Ganze zu verstehen beschäftigen wir uns zunächst mit den einzelnen Bestandteilen und beginnen mit der Translation. Als Translation wird die Übersetzung der messenger RNA(mRNA) in Aminosäuren, also die Synthese von Proteinen, verstanden. Diese Übersetzung ist in drei Schritte unterteilt und findet am Ribosom statt. Die drei Schritte der Translation sind die Initiation, die Elongation und die Termination. Die kleine Ribosomenuntereinheit bindet bei der Initiation kurz vor dem sogenannten Startcodon AUG an die mRNA. Danach folgt die Anlagerung der Initiator-transfer RNA (tRNA) und der großen Ribosomenuntereinheit an das Startcodon. Erstere ist mit der Aminosäure Methionin beladen und bindet an den Ribosomenausgangsort. Die Beladung der tRNA mit einer Aminosäure wird als Aminoacylierung bezeichnet. Dabei helfen sogenannte Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, da sie die Bindung der Aminosäure an die tRNA katalysieren. Beim zweiten Schritt der Translation, der Elongation, wird der Eingangsort des Ribosoms mit einer neuen mit einer Aminosäure beladenen tRNA und dem dazu gegenteiligen und passenden Anticodon besetzt. Zwischen unserer ersten Aminosäure Methionin und der zweiten Aminosäure wird unter Energieverbrauch und Wasserabspaltung eine Peptidbindung hergestellt. Die tRNA von Methionin verlässt nun das Ribosom über den sogenannten Ribosomenausgang. Daraufhin rückt das Ribosom ein Aminosäuren-Triplett weiter und die tRNA geht in den Ribosomenausgang über. Diese beiden Schritte wiederholen sich solange, wie kein Stoppcodon auf der mRNA zu finden ist. Sollte dies jedoch der Fall sein, so wird der dritte Schritt der Translation, die Termination, eingeleitet. Hierbei wird ein sogenanntes Stoppcodon von einem Hilfsprotein erkannt und die bereits entstandene Polypeptidkette fällt vom Ribosom ab. Dies geschieht, weil es keine weitere passende tRNA mit Anticodon zum Stoppcodon gibt. Die Polypeptidkette ist fertig und das Ribosom zerfällt in seine zwei Untereinheiten. Damit ist die die Proteinbiosynthese/Translation abgeschlossen. [Lodish et al., 2013; Will, 2014]. Zur Verinnerlichung und Veranschaulichung der Translation dient Abbildung 1.

Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)

Als nächstes kommen wir zu dem Begriff der Doppelmarkierung und was das überhaupt mit unserem Thema zu tun hat. Dies bedeutet einfach nur, dass Proteine mit sogenannten Sonden nicht nur an einer Stelle, sondern an zwei Positionen mit zwei verschiedenen Sonden markiert werden können, um anschließend ein Förster-Resonanz-Energie-Transfer – kurz FRET genannt – durchführen zu können. Aber FRET, was ist das denn jetzt nun eigentlich. Bei diesem Prinzip geht es darum, Energie strahlungsfrei von einem Fluorophor, also einer Sonde, auf einen zweiten Fluorophor zu übertragen. Bei dem ersten Fluorophor spricht man von einem Donor, während der zweite der Akzeptor ist. Das Prinzip ist dabei, dass die zwei Fluorophore, also Farbstoffe auf eine Probe aufgebracht werden und dann an jeweils unterschiedliche Strukturen binden. Dann werden die Elektronen des Donors durch Lichtenergie angeregt und die Energie wird auf den Akzeptor übertragen. Dadurch werden die Elektronen des Akzeptors angeregt und die aufgenommene Energie wird als Fluoreszenzsignal abgegeben. Häufig verwendete Fluorophor-Donor/Akzeptor-Paare sind die BODIPY 493/503, auf die wir später noch einmal eingehen werden. Allerdings gibt es einige Voraussetzungen, die dafür erfüllt sein müssen. Zum einen darf der Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor maximal fünf Nanometer betragen und die beiden müssen unterschiedliche Absorptionsspektren besitzen, allerdings muss sich das Emissionsspektrum des Donors und das Absoprtionsspektrum des Akzeptors überlappen [URL2]. Und wofür ist das ganze nun gut? Anwendung findet es vor allem bei der Bestimmung von Protein-Protein-Interaktionen, indem beispielsweise die Distanz zwischen den Fluorophoren gemessen wird. Ein Vorteil dieser Methode im Vergleich mit anderen Techniken bietet die Echtzeitmessung, die vor allem bei der Konformationsänderung eine große Rolle spielt [Schmitz und Desel, 2018]. Kommen wir nun zu unserem eigentlichen Thema, die optimierte orthogonale Translation von unnatürlichen Aminosäuren, die die spontane Doppelmarkierung von Proteinen ermöglicht.

Warum wird so etwas überhaupt gemacht?

Der effiziente, ortsspezifische Einbau von mehreren unnatürlichen Aminosäuren in Proteine ist für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich, unter anderem für die FRET-Studien und es ermöglicht die Nachverfolgung von Protein-Konformationsänderungen und gibt somit Informationen über die Proteinstruktur, Proteinfunktion und Proteindynamik. Damit können Proteine verbessert werden, die für therapeutische Zwecke genutzt werden. Des Weiteren können diese Studien zur kodierten zellulären Synthese und Evolution von unnatürlichen Polymeren beitragen [Wang et al., 2014].

Welche biologischen Bauteile werden dafür benötigt?

Für die Kodierung von mehreren unterschiedlichen unnatürlichen Aminosäuren in Zellen sind mehrere „Bauteile“ notwendig. Bei diesen handelt es sich um:

1. Zueinander orthogonale Aminoacyl-Transfer-RNA (tRNA)-Synthetase/tRNA-Paare, die in der Lage sind, unterschiedliche Aminosäuren zu erkennen.
2. Leere Codons, die neuen Aminosäuren zugeordnet werden können
3. Ein orthogonales Ribosom, das sogenannte Ribo-Q1, das Quadruplett-Codons und Amber-Codons, also die Stopp-Codons UAG dekodiert. Dies ist notwendig, da diese von natürlichen Ribosomen ineffizient dekodiert werden. Damit wird eine Reihe von Leer-Codons bereitgestellt, die dann für orthogonale Messages genutzt werden können.

Des Weiteren wurden orthogonale Ribosom-mRNA-Paare entwickelt. Dabei ist das orthogonale Ribosom spezifisch auf eine orthogonale Message ausgerichtet, was dazu führt, dass diese Ribosomen nicht für die Synthese des Proteoms verantwortlich sind, anders als es bei natürlichen Ribosomen der Fall ist. Dadurch können die synthetisch geschaffenen Ribosomen beliebig verändert werden, um eine Reihe neuer Funktionen zu erfüllen [Wang et al., 2014]. Wissenschaftler haben deswegen eine Reihe von Pyl-tRNAs entwickelt, um zu ermöglichen, dass verwandte Quadruplett-Codons auf Ribo-Q1 optimal dekodiert werden. Dazu wurde die orthogonale Translation optimiert, indem neue tRNAs verwendet wurden, die die Effizienz des Einbaus von zwei verschiedenen unnatürlichen Aminosäuren in ein einziges Polypeptid steigern. Um die Allgemeingültigkeit dieses Ansatzes zu verdeutlichen wurde eine Matrix aus unnatürlichen Aminosäuren in Proteinen codiert. Mit dieser Arbeit wurde außerdem der erste allgemeingültige Weg zur schnellen und spontanen Markierung von Proteinen an genetisch definierten Positionen mit zwei verschiedenen Sonden aufgezeigt. Genutzt wird dieser, um am Beispiel von Calmodulin (CaM) mittels FRET die Konformationsänderung nachzuverfolgen [Wang et al., 2014].

Calmodulin

Calmodulin ist ein Calcium-bindendes Protein, welches verantwortlich für die Aktivierung von Enzymen und Zellprozessen ist und in Eukaryonten hochkonserviert vorkommt. Wie in Abbildung 2 zu erkennen, ist dieses Protein hantelförmig, ca. 6,5 Nanometer lang, mit zwei globulären Domänen, die durch eine lange alpha-Helix verbunden sind. Es besteht aus 148 Aminosäuren und besitzt vier hochaffine Bindungsstellen für Calcium, jeweils zwei in den globulären Domänen in Form von Helix-Turn-Helix-Motiven, sogenannten EF-Hands. Die beiden Strukturen liegen 1,1 Nanometer auseinander und sind durch wasserstoffbrückenbindungenausbildende, antiparallele beta-Faltblätter miteinander verbunden. Später im Artikel werden wir noch einmal auf das Protein Calmodulin zurückkommen [Bachs und Agell, 1995].

Nachdem wir nun geklärt haben, warum dieses Forschungsgebiet überhaupt so wichtig und interessant ist und welche grundlegenden Bausteine benötigt werden, schauen wir uns nun die Methodik dahinter an und welche einzelnen Schritte die Wissenschaftler gegangen sind, um diesen Ansatz zu entwickeln.

Auswahl der Quadruplett-decodierenden Pyl-tRNA-Varianten

Als erstes mussten geeignete Quadruplett-decodierende Pyrrolysin(Pyl)-tRNA-Varianten ausgewählt werden. Warum werden überhaupt Pyl-tRNA-Synthetasen (PylRS) verwendet und nicht einfach andere tRNA-Synthetasen?! Das liegt daran, dass PylRS die Anticodon-Stammschleife von verwandten tRNAs (beispielsweise Pyl-tRNA CUA) nicht erkennt. Dadurch kann die ribosomale Dekodierung auf Ribo-Q1 optimiert werden, allerdings wird die Aminoacylierung durch die PylRS nicht beeinträchtigt. Zum einen sollten eine Reihe von erweiterten Anticodon/Quadruplett-Codon-Paaren, und zum anderen Pyl-tRNA-Varianten entdeckt werden, die auf Ribo-Q1 effizient und spezifisch dekodiert werden. Dazu wurden als potentielle Ziele vier verschiedene Quadruplett-Codons ausgewählt, nämlich AGGA, AGTA, TAGA und CTAG, die für die Dekodierung durch entwickelte Pyl-tRNAXXXX-Varianten auf Ribo-Q1 verwendet werden sollten. Dabei steht XXXX für das Anticodon, das zu einem bestimmten Codon komplementär ist. Es wurden Quadruplett-Codons ausgewählt und als erster Schritt sollten die Pyl-tRNA-Varianten ausgewählt werden, die die ausgewählten Quadruplett-Codons auf Ribo-Q1 effizient dekodieren. Dazu wurden Sättigungsmutagenese-Bibliotheken Pyl-tRNA (N8)XXXX erstellt, indem eine Variierung der Sequenz von acht Nukleotiden in der Anticodon-Stammschleife in allen möglichen Kombinationen vorgenommen wurde [Wang et al., 2014].

Nachdem diese Bibliotheken erstellt wurden, wurde eine zweistufige Selektion durchgeführt, um die gewünschten tRNAs zu entdecken. In der Abbildung 3 ist dieses Verfahren noch einmal veranschaulicht. Als erstes wurde eine negative Selektion durchgeführt (linker Fall), um die Mitglieder der Bibliothek zu entfernen, die durch endogene Synthetasen mit natürlichen Aminosäuren falsch aminoacyliert sind. Die endogene Synthetase aminoacyliert die synthetische Pyl-tRNA, damit die Aminosäure andockt. Anschließend kann diese auf dem Codon an der mRNA andocken und das Enzym Barnase auf Ribo-Q1 kann vollständig synthetisiert werden, was bei Bindung zum Zelltod führt. Im mittleren Fall ist noch einmal veranschaulicht, dass die dezimierte Bibliothek weiterbetrachtet wird, da diejenigen Pyl-tRNAs, die „überlebt“ haben, entweder keine Substrate für die endogenen Synthetasen sind oder/und ihr Quadruplett-Codon auf Ribo-Q1 nicht dekodieren können. Danach wurde eine positive Selektion durchgeführt zur Auswahl der Bibliotheksmitglieder, die durch PylRS mit einer unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert werden und als Reaktion auf ein verwandtes Quadruplett-Codon in der orthogonalen mRNA (O-mRNA) effizient auf Ribo-Q1 dekodiert werden. Im rechten Fall sehen wir die positive Selektion mit einer unnatürlichen Aminosäure. Dabei wird die Pyl-tRNA durch eine PylRS aktiviert, um mit der unnatürlichen Aminosäure beladen werden zu können. Die tRNA dockt dann an das Quadruplett-Codon der mRNA an und es wird Chloramphenicolacetyltransferase (cat) gebildet. Escherichia coli erlangt eine Resistenz gegen cat, daher werden die übrig gebliebenen Proben auf einem Selektivmedium ausplattiert und die Klone aus jeder Selektion werden sequenziert, phänotypisiert und anschließend werden die Paare weiter charakterisiert, die in Gegenwart der unnatürlichen Aminosäure die höchste Resistenz und in Abwesenheit der unnatürlichen Aminosäure die niedrigste Resistenz aufwiesen [Wang et al., 2014].

Um diesen Abschnitt noch einmal kurz und bündig darzustellen und einen Überblick zu geben, ist in der untenstehenden Abbildung noch einmal ein schematischer Ablauf dargestellt.

Verbesserter Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Quadruplett-Codons

Nachdem wir nun die tRNA-Varianten ausgewählt haben, widmen wir uns dem verbesserten Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in Quadruplett-Codons (siehe Abbildung 5). Dabei wurde gezeigt, dass die Quadruplett-Decodiereffizienz und die Spezifität der entwickelten PylRS/Pyl-tRNA-Paare auf Ribo-Q1 verbessert wurde. Dies führt zu einer erhöhten Produktion von einem rekombinanten Protein, das eine unbekannte Aminosäure trägt. Gleichzeitig dazu sollte ein Vergleichsmaßstab geliefert werden, für den Einbau von unnatürlichen Aminosäuren unter der Verwendung von den entwickelten Pyl-tRNAXXXX-Systemen. Dies geschah unter der Methodik der Exprimierung und Reinigung eines Fusionsproteins. Dieses Protein ist fusioniert aus Gluthationtransferase (GST) und Calmodulin (GST-Cam) und es enthält ortsspezifisch p-Azidophenylalanin. Bei der Zugabe von p-Azidophenylalanin wurde ungefähr 13 % Protein voller Länge gebildet, während in Abwesenheit von p-Azidophenylalanin nur 7 % Protein voller Länge gebildet wurde. Das Ergebnis ist also, dass durch die verbesserte Quadruplett-Dekodierungseffizienz der entwickelten PylRS /Pyl-tRNAXXXX-Paare auf Ribo-Q1 eine erhöhte Produktion von rekombinantem Protein mit unnatürlichen Aminosäuren. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass als Reaktion auf Quadruplett-Codons unter der Verwendung der entwickelten tRNAs eine Reihe von unnatürlichen Aminosäuren eingebaut werden kann. Dazu wurde ein Vergleich angestellt. Es wurde die Effizienz des Einbaus unter Verwendung von chemisch unterschiedlichen unnatürlichen Aminosäuren verglichen. Es wurden drei unnatürliche Aminosäuren verwendet, bei allen drei Aminosäuren handelt es sich um Derivate des Alanins. Die Effizienz des Einbaus dieser drei unnatürlichen Aminosäuren unter Verwendung der entwickelten pyl-tRNAXXXX lag zwischen 27 % und 62 %. Damit war die Effizienz wesentlich höher als die Effizienz des Einbaus von unnatürlichen Aminosäuren unter der Verwendung von anderen Synthetase/tRNA-Paaren [Wang et al., 2014].

Ortsspezifische Doppelmarkierung von Proteinen unter physiologischen Bedingungen

Nun sind wir quasi schon auf den letzten Metern und kommen zu diesem ominösen FRET, mit dem wir uns zu Beginn schon einmal kurz beschäftigt haben. Zunächst wurden dafür die FRET-Sonden ausgewählt, die in das Protein eingeführt wurden. Dabei handelt es sich um eine BODIPY-FL-Sonde als Donor und eine BODIPY-TMR X-Sonde als Akzeptor. Bei beiden handelt es sich um chemische Verbindungen die unter anderem die Elemente Bor und Fluor enthalten [Tram et al., 2009] und die ausgewählt wurden, da sich ihr Emissions- und Anregungsspektrum überlappen, was, wie wir bereits gelernt haben, eine der Voraussetzungen für FRET ist. Für die Einführung der Sonden in die Proteine wurde eine native chemische Ligation verwendet. Die Reaktionen, die von den Wissenschaftlern charakterisiert wurden, können genutzt werden, um Proteine mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren schnell und spontan zu markieren und sie somit für FRET-Studien zu verwenden. Dabei handelt es sich um inverse Diels-Alder-Reaktionen. Um dies zu verdeutlichen, sehen wir uns die Abbildung 6 an. In dunkelgrün ist unser Protein, das Calmodulin, dargestellt. An Position eins dieses Proteins befindet sich eine Aminosäure (5) und an Position 149 befindet sich eine andere Aminosäure (8). Nun wurden diese beiden Aminosäuren jeweils mit zwei unterschiedlichen Aminosäuren markiert, nämlich die Aminosäure 8 mit einem BODIPY-FL-aktivierten Tetrazin-Konjugat 9, wie in der Abbildung in hellgrün zu sehen, und die Aminosäure 5 mit einem BODIPY-TMR-X-Bicyclononyne-Konjugat 10, was in der Abbildung in rot dargestellt ist. Dadurch wurde das doppelt markierte Protein (CaM 5-10 1-8-9 149), in der Abbildung rechts dargestellt, erzeugt [Wang et al., 2014].

Verwendung von FRET zur Verfolgung der Konformationsänderung

Das FRET-Signal, das beobachtet wurde, ist empfindlich gegenüber steigenden Harnstoffkonzentrationen, wie die Abbildung 7 erkennen lässt. Auf der x-Achse ist die Wellenlänge der Emission in Nanometern aufgetragen und auf der y-Achse die Fluoreszenzintensität. Mit steigender Harnstoffkonzentration nimmt das Donorfluoreszenzsignal (linker Peak) zu und das Akzeptorfluoreszenzsignal (rechter Peak) ab. Im denaturierten Zustand bewegen sich die Fluorophore weiter auseinander und das Experiment zeigt, dass die Verfolgung der Konformationsänderung mit dieser Strategie zur Proteinmarkierung getätigt werden kann [Wang et al., 2014].

Literatur

• • Bachs, O., Agell, N. (1995): Calcium & Calmodulin Function in the Cell Nucleus. Berlin.
  • Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C. A., Krieger, M., Bretscher, A., Ploegh, H., Amon, A., and Scott, M. P. (2013): Molecular Cell Biology. Katherine Ahr Parker. New York.
  • Schmitz, S., Desel, C. (2018): Der Experimentator Zellbiologie. Springer Spektrum. 1. Auflage
  • Wang, Kaihang et al. (2014): Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. nature chemistry. VOL 6: 393 – 403
  • Will, Horst (2014): Molekularbiologie kurz und bündig. Springer-Verlag Berlin Heidelberg
  • Tram K., Yan, H., Jenkins, H. A., Vassiliev, S., Bruce, D. (2009). "The synthesis and crystal structure of unsubstituted 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY)". Dyes and Pigments. 82 (3): 392–395
  • [URL1] (31.08.2020): Verfasser unbekannt: Translation (Biologie). URL: https://de.wikipedia.org/wiki/Translation (Biologie)
  • [URL2] (31.08.2020): Lichtscheidt, Irene K.: Spezialtechniken FRET. URL: https://www.univie.ac.at/mikroskopie/3 fluoreszenz/clsm/5d fret.htm
  • [URL3] (31.08.2020): Verfasser unbekannt: Calmodulin. URL: https://en.wikipedia.org/wiki/Calmodulin