Synthetische Biologie – Themen

Multi-Input CRISPR/Cas Schaltkreise

von Susanne Jahn

Einführung

Das wesentliche Merkmal von genetischen Schaltkreisen liegt in der Imitation logischer Funktionen von elektrischen Schaltungen. Es werden also metabolische Prozesse vereinfacht, um deren Eigenschaften und Wirken auf das biologische System, also dem Mikroorganismus, zu verstehen und zu regulieren [3].

Synthetisch biologische Schaltkreise können verschiedene logische Funktionen ausfüllen. Diese Funktionen können in Gatter zusammengefasst werden. Beispiele für diese logischen Funktionen können AND, OR und NOR-Gatter sein. Diese Gatter werden durch Transkriptionsfaktoren gesteuert. Transkriptionsfaktoren sind Proteine, welche an DNA-regulierenden Sequenzen binden und somit die Transkription der Gene beeinflussen [6].

Bei einem OR-Gatter wird das System durch zwei Transkriptionsfaktoren (TF) angeschaltet, dabei findet zwischen diesen Transkriptionsfaktoren eine kooperative Interaktion statt und sie werden an die TF-Bindungsstelle (TF site) gebunden. Dabei muss mindestens einer der beiden TFs vorhanden sein, damit die RNA-Polymerase (RNAP) die Sequenz ablesen kann und im Folgenden das Protein entstehen kann, es kommt also zum Output [6].

Abb. 1: OR-Gatter.

2ei einem AND-Gatter wird das Aktivieren eines Promotors ebenfalls durch den Transkriptionsfaktor A bestimmt, welcher gebunden wird. Dabei ist er jedoch abhängig von einem Induktor B [6].

Abb. 2: UND-Gatter.

Das sind lediglich Beispiele, die das Funktionsprinzip verdeutlichen sollen. Im Weiterem sollen kompliziertere Schaltungen anhand von Genregulationen erklärt werden, wobei die CRISPR/Cas-Methode Anwendung findet.

Der Nutzen synthetisch biologischer Schaltkreise besteht darin, dass es möglich ist, die Produktion spezifischer Stoffe in einem biologischen System zu optimieren. Dazu werden bestimmte Stoffwechselwege auf deren Effizienz überprüft und dementsprechend reguliert. So werden zelluläre Systeme zu konstruierten Maschinen und können durch die Anwendung von Logikelementen programmiert werden. Dieses Programmieren funktioniert über das Hinzufügen oder Ein- und Ausschalten bestimmter Gene. Das Ein- und Ausschalten eines bestimmten Gens setzt also voraus, dass das Wissen vorhanden ist, welches Merkmal codiert wird und wo sich das entsprechende Gen auf dem DNA- oder RNA-Strang befindet [3]. Um eine solche „Programmierbarkeit“ der Erbinformationen durchführen zu können, gibt es verschiedene Methoden. Im Folgenden wird sich jedoch auf die CRISPR/Cas-Methode konzentriert [5].

CRISPR/Cas

Die bereits seit 2012 bekannte, neu entwickelte Methode CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), umgangssprachlich auch Genschere genannt, bietet bisher nie dagewesene Möglichkeiten in den Life Sciences.

Bei CRISPR/Cas handelt es sich um eine molekularbiologische Methode, mit deren Hilfe ein zielgerichtetes Schneiden und Verändern der DNA möglich ist. Somit kommt diese Methode beim Genome Editing zum Einsatz. Mit CRISPR/Cas können Gene eingefügt, entfernt oder ausgeschalten werden [2]. Die Methode basiert auf einem bakteriellen antiviralen Abwehrmechanismus. Bei der Infektion eines Bakteriums durch einen Phagen, injiziert dieser Phage seine DNA in die Zelle.

Abb. 3: A) Funktionalität des CRISPR/Cas-Systems; B) Zusammensetzung der guideRNA.

Diese DNA wird unspezifisch durch Nukleasen geschnitten. Nach dem Schneiden werden die DNA-Fragmente in das Bakteriengenom eingefügt. Die eingefügte Phagen-DNA wird als „Spacer“ bezeichnet. Diese „Spacer“ werden durch „Repeats“ getrennt (Abb. 3 A). Die bestehende RNA aus „Spacer“ und „Repeats“ wird als crRNA (CRISPR-RNA) zusammengefasst. Ein weiterer Bestandteil des Systems ist die tracrRNA (trans activating crRNA), welche sich über die linkerRNA mit der crRNA verbindet und damit ein ausgereiftes und funktionsfähiges Molekül darstellt. Die Verbindung aus tracrRNA und crRNA wird als guideRNA bezeichnet (Abb. 3 B) [1].

Diese verschiedenen RNAs sind relevant für das Cas-Protein. Das Cas-Protein ist eine Endonuklease und Ribonukleaseprotein, welches die Bakterien in ihrem Abwehrmechanismus nutzen, um die virale DNA zu zerschneiden. Es gibt verschiedene Cas-Proteine mit unterschiedlichen Eigenschaften. Im Folgendem wird jedoch sich lediglich auf das Cas9-Protein bezogen. Die crRNA liefert eine Erkennungssequenz für das Cas9, welches die DNA an einer bestimmten Stelle durchtrennen soll. Die passende Erkennungssequenz reicht allein aber nicht aus. Es ist zudem ein „protospacer adjacent motif“ (PAM) notwendig, damit Cas9 an die DNA binden kann. Nur wenn ein solcher Abschnitt (zwei Guanin- und eine beliebige Base) neben der Erkennungssequenz liegt, kann die Bindung zwischen Cas9 und der DNA stattfinden. Es entspiralisieren sich daraufhin beide DNA-Stränge und das Enzym durchtrennt beide an derselben Stelle. Da das Erbgut des Bakteriums keine PAMs besitzt, ist es davor geschützt vom Cas9 geschnitten zu werden [4]. Nach dem die DNA geschnitten wurde, können verschiedene Prozesse stattfinden. Ein Vorgang ist das „non-homologous end joining“ (NHEJ) bei dem zwei DNA-Fragmente wieder zusammengefügt werden ohne dass eine Reparaturvorlage genutzt wird. Es handelt sich dabei um einen schnellen und zelleigenen Reparaturmechanismus, durch welchen Deletionen und Insertionen entstehen können, die für die Zelle schädlich wären. Der andere Mechanismus ist die homologe Rekombination („homology directed repair“) mit dem Organismen Brüche in homologen, doppelsträngigen DNA-Molekülen reparieren können. Dabei wird die defekte Stelle in der Erbinformation mit einer ähnlichen Nukleotidsequenz eines zweiten DNA-Moleküls ausgetauscht. Dabei dient die Information auf dem unbeschädigten Chromosom als Vorlage. Soll eine bestimmte DNA-Sequenz in die Schnittstelle eingefügt werden, wird diese hinzugegeben und dient somit als Vorlage bei der homologen Rekombination [1].

So kann diese molekularbiologische Methode genutzt werden, um spezifische „Messelemente“ eines genetischen Schaltkreises hinzuzufügen, auszuschalten oder einzuschalten.

Anwendung von CRISPR/Cas in genetischen Schaltkreisen

Bei der Anwendung des CRISPR/Cas-Systems auf genetische Schaltkreise wird ein Komplex aus der sgRNA (small guide RNA) und dem dCas9 (dead Cas9) genutzt. Bei dCas9 handelt es sich um ein Cas9-Protein, welches keine Nuklease-Funktion mehr erfüllt und dementsprechend keine Spaltung des RNA-Bereichs stattfindet. Die sgRNA besitzt einen „Griff“, wodurch sie an das Cas9 gebunden werden kann. Die sgRNA wird mithilfe des dCas9-Proteins transportiert und bindet schließlich an dem Bereich der RNA, welcher komplementär ist. Da die Nuklease-Funktion des dCas9 deaktiviert ist, fungiert dieser Komplex als Repressor, da kein Binden der Polymerase möglich ist [5].

NOT-Gatter

Als Beispiel wird hier das NOT-Gatter mithilfe des sgRNA und dCas9-Komplexes dargestellt. CRISPR/Cas-basierte NOT-Gatter bestehen aus einem dCas9-Protein, einem Input-Promoter, welcher die sgRNA transkribiert, und einem synthetischen Output-Promotor mit einem sgRNA-Operator. Der Operator stellt damit eine Region in der Nähe des Promotors dar, an der die sgRNA binden kann. Wenn sich die sgRNA durch ihren „Griff“ mit dem dCas9-Protein verbindet, bindet sie ebenso an den Operator, wodurch eine Bindung der RNA-Polymerase verhindert wird und somit eine Unterdrückung des Output-Promotors bewirkt (Abb. 4) [5].

Abb. 4: NOT-Gatter eines sgRNA und dCas9 Komplexes.

Schaltung NOT- und NOR-Gatter

Mithilfe dieser Methode ist es möglich komplexe Schaltungen aufzubauen, indem der der Output des ersten Schaltungselements der Input des nächsten darstellt. So können Kreisläufe in einer Kaskade aufgebaut werden, als Beispiel hierfür dient das NOR-Gatter mit zwei Transkriptionseinheiten (Abb. 5). Jedes Gatter besitzt einen anderen Eingangspromotor. Sollte also eine der beiden Promotoren aktiv sein, wird die sgRNA transkribiert und unterdrückt den Output-Promotor [5].

Abb. 5: NOR-Gatter mit zwei Transkriptionseinheiten.

Bei der Kopplung eines synthetischen Schaltkreises mit einem nativen E.coli-Netzwerk zielt die sgRNA auf einem Transkriptionsfaktor ab, welcher auf dem Wirtsgenom liegt. Es entsteht eine Verbindung zwischen dem synthetischen und natürlichen Netzwerk. Dadurch wird die Möglichkeit gegeben, einen verallgemeinerbaren Mechanismus zu schaffen. Durch diesen Mechanismus ist es möglich den Wirtsphänotyp abhängig von den Bedingungen, welche durch den synthetischen Schaltkreis vorgegeben werden, zu regulieren. Somit können zelluläre Prozesse durch die sgRNA und das dCas9-Protein gesteuert werden [5].

Am Beispiel des MalT-Gens wird die Verwendung der verschiedenen Gatter deutlich, welche durch sgRNA und dCas9 aufgebaut werden können. Die sgRNA zielt auf das MalT-Gen des Wirtsorganismus ab, in diesem Beispiel ein E.coli-Bakterium. Die Funktion des MalT-Gens besteht im Organismus darin, dass es als positiver Regulator der Maltose-Verwertungsoperone fungiert. Das heißt, ein Knockout, also Ausschalten, dieses Gens würde zu einer Veränderung der Zuckerverwertung führen und Auswirkungen auf den zellulären Phänotyp haben. Die Veränderung bezieht sich dabei ebenfalls auf die niedrigere Expression des Lambdaphagenrezeptors, wodurch die Phageninfektiosität gesenkt wird. Es wurden dazu ein synthetischer Schaltkreis mit einem Wildtyp verglichen. Hierfür kamen die NOR- und NOT-Gatter zum Einsatz (Abb. 6). Sollte einer der beiden Induktoren (Output des NOR-Gatters) aktiv sein, würde das zu einer Wildtyp-ähnlichen Phageninfektiosität führen. Zur Überprüfung der Induktoren wird das RFP (red fluorescent protein) eingesetzt. Wenn also Induktoren vorhanden sind, wird ein Signal durch eine rote Fluoreszenz freigesetzt. Im Fall dessen, dass die Induktoren fehlen, kommt es zu einem Knockout des MalT-Gens. Zellen, die dieses Prinzip beinhalten, zeigten eine deutlich niedrigere Phageninfektiosität [5].

Abb. 6: Schaltung aus NOR- und NOT-Gatter mit RFP-Output.

Fazit

In der Regel sind Transkriptionsgatter zur Regulation von Schaltkreisen aus DNA-bindenden Proteinen aufgebaut. Bei dieser typischen Methode besteht jedoch die Gefahr, dass orthologe Proteine mit der Bindungsstelle des jeweilig anderen reagieren können. Aufgrund dessen ist es wichtig orthologe Proteine zu finden, welche hinsichtlich ihrer Domänen auf verschiedene Operatoren abzielen. Um diese Proteine zu ermitteln, nutzt man das bioinformatische Data Mining. Bei der Verwendung der CRISPR/Cas-Methode besteht die Gefahr von Off-Target-Effekten. Jedoch ist die Variabilität der sgRNA so hoch, dass es möglich ist, die Sequenz so unähnlich wie möglich gegenüber dem Wirtsgenom zu gestalten. Dadurch ist die Wahrscheinlich von Off-Target-Effekten sehr gering. Weiterhin ist ein leichtes Verbinden der Transkriptionsgatter miteinander möglich, wodurch komplexere Schaltkreise aufgebaut werden können. Durch die freie Gestaltung der sgRNA entsteht sowohl ein hoher Dynamikbereich als auch eine hohe Spezifität [5].

Die Schaltkreise können dazu genutzt werden, um eine Regulierung der Wirtsgene eines Organismus durchzuführen und damit eine Kontrolle über die zellulären Reaktionen zu haben. Beispielsweise können Zellen so programmiert werden, dass sie die Zelldichte in einem Fermenter erfassen und mit der Expression entsprechender Enzyme reagieren [5].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese logischen Funktionsgatter basierend auf sgRNA und dCas9 zahlreiche Vorteile besitzen, welche sich insbesondere auf die Komplexität der Schaltkreise und auf die Auswahl der Transkriptionsfaktoren beziehen. Des Weiteren sind die Gatter relativ klein gestaltet, was ein leichtes Synthetisieren als Oligos ermöglicht. Die Operatoren, welche für die sgRNA genutzt werden, sind ebenfalls klein (lediglich 13bp) und können somit leichter in die bestehende Sequenz eingefügt werden. Die CRISPR/Cas-Methode bietet zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten, welche auch im Bereich der genetischen Schaltkreise zum Tragen kommen. Hierbei wurde eine spezifischere und dynamischere Methode entwickelt, um eine Programmierbarkeit der Zellen herzustellen. Dennoch ist es erforderlich, dass das System weiter angepasst wird, da beispielsweise eine Überexpression des dCas9-Proteins sich toxisch auf die Zellen auswirkt [5].

Literatur

  1. García-Martínez J, Maldonado R D, Guzmán N M, Mojica F J M (2018) The CRISPR conundrum: evolve and maybe die, or survive and risk stagnation. Microbial cell (Graz, Austria) 5: 262–268.
  2. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna J A, Charpentier E (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science (New York, N.Y.) 337: 816–821.
  3. Kobayashi Hideki, Mads Kærn, Michihiro Araki, Kristy Chung, Timothy S. Gardner, Charles R. Cantor (2004) Programmable cells: Interfacing natural and engineered gene networks. PNAS: 8414–8419.
  4. Max-Planck-Gesellschaft (2020) CRISPR-Cas9. Arbeitsweise von CRISPR-Cas9. https://www.mpg.de/11032932/crispr-cas9-mechanismus. (01.08.2020)
  5. Nielsen A A K, Voigt C A (2014) Multi-input CRISPR/Cas genetic circuits that interface host regulatory networks. Molecular systems biology: 763.
  6. Silva-Rocha R, Lorenzo V de (2008) Mining logic gates in prokaryotic transcriptional regulation networks. FEBS letters 582: 1237–1244.

 

 

 

einfuehrung/circuitcrispr2.txt · Zuletzt geändert: 2020/12/19 20:03 von Röbbe Wünschiers
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