Synthetische Biologie – Themen

Toehold Switches

von Vanessa Schumann

Einleitung

Wie bereits beschrieben wurde sind genetische Schaltkreise von hoher Bedeutung in der synthetischen Biologie und ihre Einsatzmöglichkeiten enorm vielfältig. Neben dem Flip-Flop-Schalter [5] (auch: bistabiler Schalter) oder dem Tet-System [5] stellen die neuartigen Toehold Switches eine weitere Anwendung der synthetischen Biologie dar. Die neu entworfenen künstlichen Genschaltkreise sollen Moleküle in ihrer Umgebung erkennen und auf diese Moleküle spezifisch reagieren. Man möchte dadurch beispielsweise Gene regulieren. Kann die Expression der Genprodukte mit einem RNA-Input verknüpft werden, könnten unter anderem präzise und kostengünstige Diagnosetechniken oder Diagnoseverfahren entworfen werden. Damit wäre eine Entwicklung von Zellen als diagnostische/ therapeutische Geräte oder als „Fabriken“ zur Herstellung von klinisch oder industriell begehrten Molekülen denkbar. Ein weiteres großes Ziel der synthetischen Biologie ist der Einsatz solcher genetischer Schaltkreise außerhalb lebender Zellen, zum Beispiel indem sie an Trägermaterialien wie Papier immobilisiert werden. Bisher konnten diese Ziele noch nicht einwandfrei erreicht werden, da vorher zwei Hauptprobleme gelöst werden müssen:

Problem 1: Die kompatiblen Module zur Interpretation der Umgebung und zur zuverlässigen Kontrolle der Genexpression sind nicht in ausreichendem Maß vorhanden.

Problem 2: Die Integration multipler Komponenten in ein großes, komplexes Netzwerk ist schwierig. → Als Lösung für diese Probleme wurden die Toehold Switches entwickelt.

RNA-based regulatory elements

RNA-based regulatory elements [1] bilden die Grundlage für die Entwicklung der Toehold Switches. Das Prinzip für diesen neuen Schalter hat man sich aus der Natur abgeschaut. Denn auch die Natur hält einige RNA-basierte „Module“ bereit, welche auf transkriptionellen und posttranskriptionlen Leveln wirken. Nach deren Vorbild hat man dann die RNA-regulierenden Elemente (synthetische RNA-Regulatoren) abgeleitet und weiterentwickelt. Beispielsweise wurden Riboregulatoren konzipiert, die die Translation und Transkription in Wechselwirkung mit einer cognate RNA kontrollieren. Dadurch wird das Ablesen eines Gen ermöglicht oder verhindert, je nachdem, ob die cognate RNA vorhanden ist oder nicht. Das sind sozusagen die Vorläufer der Toehold Switches.

Aufbau und Funktionsweise der Toehold Switches

Die Toehold Switches [3] bestehen aus zwei RNA-Strängen: der „Switch-RNA“ und der „Trigger-RNA“. Die Trigger-RNA ist im Gegensatz zur Switch-RNA einfacher strukturiert: Sie ist einzelsträngig ca. 30 Nukleotide lang und komplementär zur Toehold-Domäne der Switch-RNA. Die Switch-RNA ist im Gegensatz dazu komplexer aufgebaut (Abb. 1). Die Switch-RNA besteht aus der Toehold-Domäne, dem Hairpin, einer Linker-Sequenz und der Sequenz des Gene of interest. Der Hairpin bildet eine doppelsträngige RNA-Struktur, in welcher die Shine-Dalgarno-Sequenz (Ribosomenbindestelle, RBS) sowie das Start-Codon verdeckt werden. Damit dient der Hairpin als Repressor des Gene of interest, wenn keine Trigger-RNA gebunden ist. Am 5’-Ende des Hairpins liegt die ca. 12 nt lange Toehold-Domäne. Sie bildet die Reaktionsinitiationsstelle mit der Trigger-RNA. Am 3’-Ende des Hairpins befindet sich die Linkersequenz. Diese Sequenz ist ca. 21 Nukleotide lang und wird am N-Terminus des Gene of interest angefügt. In der Sequenz zwischen Start-Codon und der Sequenz des Gene of interest (in Abb. 1 lila) darf kein Stop-Codon liegen, dies wurde beim Design der Switches ebenfalls bedacht. Denn andernfalls würde die Expression des Gene of interest durch das Stopcodon abbrechen.

Abb. 1: XXX.

Abbildung 1: Aufbau und Funktionsweise der Toehold Switches: im oberen Teil der Abbildung ist der Aufbau der Switch- RNA dargestellt. Im unteren Teil wird die Funktionsweise und die Interaktion zwischen Switch-RNA und Trigger-RNA dargestellt. Diese Abbildung wurde mit BioRender erstellt.

Funktionsweise

Wie schon erwähnt dient der Hairpin der Switch-RNA als Repressor, wenn keine Trigger-RNA gebunden ist. Die Toehold Switches wechseln also von einer Sekundärstruktur, die die Translation verhindert, in eine Konformation, in der die Translation des Gene of interest möglich ist. Dafür muss die Trigger-RNA an die komplementäre Toehold-Domäne binden. Für die Translation des Gene of interest sind zwei Abschnitte der Sequenz entscheidend: die Shine-Dalgarno-Sequenz und Sequenzabschnitte in unmittelbarer Umgebung des Start-Codons. Die Toehold Switches wurd so konstruiert, dass der Hairpin beide Bereiche verdeckt, um somit die Translation zu reprimieren. Zwischen Switch-RNA und Trigger-RNA finden linear-linear Wechselwirkungen statt, damit die Trigger-RNA an der Toehold-Domäne der Switch-RNA binden kann. Dadurch öffnet sich die Hairpin-Struktur, sodass Shine-Dalgarno-Sequenz und Start-Codon frei zugänglich für die nachfolgende Translation des Gene of interest sind. Die Funktionsweise wird in Abb. 1 dargestellt.

Riboregulatoren werden hinsichtlich der initialen RNA-RNA-Interaktionen unterschieden. Bei den neuen Toehold-Switches wurden beim Design statt loop-loop-Interaktionen (oder loop-linear-Interaktionen) linear-linear-Interaktionen verwendet. Diese stellten sich hinsichtlich der Reaktionskinetik und Thermodynamik als vorteilhafter heraus. Die linerar-linear-Aminosäure-Interaktionen wurden in vitro erschaffen und fokussieren sich auf die sogenannten „Toehold-based strand displacement reactions“. Ein weiterer Vorteil dieser Interaktionen ist, dass eine einfache Abstimmung der Translationseffizienz durch RBS-Engineering stattfinden kann.

Entwicklung der Toehold Switches

Toehold Switches sind prokaryotische Riboregulatoren und bestehen aus synthetisch hergestellten de-novo RNAs. Sie erlauben eine präzise Kontrolle über die Expression eines Gens. Am Anfang der Entwicklung wurden die Toehold Switches in silico designed. Das bedeutet sie wurden zuerst am Computer erzeugt und dann später in vivo, also in lebenden Modellorganismen, getestet. Für das in silico Design der Toehold Switches wurde das NUPACK-Nukleinsäuresequenzdesign-Paket verwendet. Dabei handelt es sich um ein Softwarpaket für die Analyse/das Design von Nukleinsäurestrukturen, -devices und -systemen. Dieser Algorithmus wurde in den ersten Schritten der Entwicklung verwendet, um mögliche passende RNA-Sequenzen zu berechnen, schrittweise anzupassen und zu verfeinern. Weiterhin wurden Bibliotheken von de-novo designten Translationsaktivatoren generiert, welche die gewünschten Parameter erfüllen. Dazu wurden die Sekundärstruktur des Toehold Switches sowie konservierte Sequenzen und die Toehold-Domäne definiert. Nachdem die computergestützten Design-Vorgänge abgeschlossen waren und die Bibliothek mit den am besten geeigneten Switches erstellt war, wurden Versuche in vivo durchgeführt. Dabei waren einige Eigenschaften der Regulatoren besonders von Bedeutung: u. a. die Orthogonalität, die Thermodynamik und der Crosstalk. Durch deren Untersuchungen sollte ausgeschlossen werden, dass sich die einzelnen Komponenten gegenseitig beeinflussen. Die neu entwickelten Toehold Switchen waren somit mit einigen vorteilhaften Eigenschaften ausgestattet: Durch ihre Induzierbarkeit können sie auf bestimmte Signale reagieren. Diese Reaktion ist jedoch auf keine bestimmte Sequenz festgelegt, dadurch sind die Toehold Switches vielseitig einsetzbar. Somit finden die Toehold Switches verschiedene Anwendungen in der synthetischen Biologie z.B. beim Programmieren des Zellverhaltens. Neben der Vielseitigkeit sind die Orthogonalität, die Programmierbarkeit und der große dynamische Bereich weitere Vorteile der Toehold Switches. Somit bieten sie das Potenzial zu leistungsstarken Plattformen für die Erfassung und/oder Programmierung von internen Zuständen in lebenden Zellen.

Anwendung

Toehold Switches bieten vielseitige Anwendungsmöglichkeiten. Mit ihrer Hilfe können genetische Schaltkreise konstruiert werden und gleichzeitig duzende Komponenten in einer Zelle gleichzeitig reguliert werden. Man konnte ein 4-Input-UND-Gatter generieren, bestehend aus drei Toehold Switches zu zwei orthogonalen Transkriptionsfaktoren und einem GFP-Reporter. Weiterhin können Toehold Switches als Sensoren für endogene RNAs in vivo eingesetzt werden. Dazu wird der Toehold Switch in das Genom integriert, und kann somit die endogene Genexpression regulieren. Es wurden Plasmide konstruiert, die einen Toehold Switch und einen Kanamycin-Resistenzmarker (Antibiotikaresistenz-Marker) enthielten. Der Resistenzmarker wurde von einem Paar FRT-Stellen (Flippase recognition target - Stellen, bei site-directed recombination technologies eingesetzt) flankiert. Mit Hilfe der λ-Red-Rekombi-nation wurden lineare DNA-Fragmente upstream der gewählten chromosomalen Gene eingefügt. Der resultierende E. coli-Stamm enthält eine funktionsfähige Kopie des Zielgens im Chromosom, die jedoch durch die co-transkribierte Switch-RNA deaktiviert ist. Für ein aktives Zielgen muss die Expression einer kognitiven Trigger-RNA stattfinden. Am konkreten Beispiel wurde ein Toehold Switch vor das lacZ-Gen in E. coli eingefügt. Das lacZ-Gen codiert im Lactose-Operon für das Enzym β-Galactosidase und wurde durch den Toehold Switch „ausgeschaltet“. Da das Lactose-Operon transkriptionell durch Lactose (oder IPTG) reguliert wird, zeigten die editieren E. coli-Stämme ein schwierigeres Verhalten. Neben der Trigger-RNA sind zwingend Lactose oder IPTG notwendig, damit die Expression der β-Galactosidase „eingeschalten“ werden kann. Dieses Verhalten führte zu einem genetischen UND-Kreislauf, der transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulation kombiniert. Die Expression von β-Galactosidase kann sehr einfach auf X-Gal-haltigem Medium verfolgt werden. Der Farbstoff wird durch das Enzym gespalten, sodass die Kolonien eine Blaufärbung erhalten. Schematisch ist dieser Zusammenhang in Abb. 2 dargestellt.

Abb. 2: Schematische Darstellung der Regulation des lacZ-Gens durch einen Toehold Switch: nur wenn sowohl Trigger-RNA als auch Lactose/IPTG vorhanden sind, wird beta-Galactosidase exprimiert und die Kolonien erscheinen auf X-Gal-haltigem Medium blau. Diese Abbildung wurde mit BioRender erstellt.

Literatur

  1. Alexander A. Green, Pamela A. Silver, James J. Collins, Peng Yin. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression Cell 159, 925–939, November 6, 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.10.002
  2. Alexander A. Green, Pamela A. Silver, James J. Collins, and Peng Yin: Supplemental Information Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell, Volume 159. https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(14)01289-6
  3. Simon Ausländer, Martin Fussenegger Toehold gene switches make big footprints]] Nature, 516, Dezember 2014. https://www.nature.com/articles/516333a
  4. Wyss Institute - Center for Life Science Bldg. Toehold Switches for Synthetic Biology. https://wyss.harvard.edu/technology/toehold-switches-for-synthetic-biology/ (11.04.2020)
  5. T. Peztzold, M. Kreuzer Genetische Schaltkreise. https://www.staff.hs-mittweida.de/wuenschi/synbiol/seminar2013/schaltkreise/Schaltkreis.html (24.08.2020)
einfuehrung/circuittoehold.txt · Zuletzt geändert: 2020/12/19 20:52 von Röbbe Wünschiers
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