Synthetische Biologie – Themen

Orthogonale designte Transktiptionsfaktoren

von Philipp Schilbach

Einleitung

Der cI-Repressor ist ein wichtiges genetisches Element in der synthetischen Biologie zum Erstellen von synthetischen Genregulationsschaltkreisen. Im hier beschriebenen Paper wird der erste Satz von Doppelaktivatoren-Repressorschaltern basierend auf dem cI-Repressor für orthogonale Logikgatter vorgestellt. Eingesetzt sollen diese konstruierten Schaltkreise zur Aktivierung oder Inhibierung von Genen. Ziel dieses Papers war es somit das bestehende Set von cI-Bindeproteine zu erweitern und komplexere Genschaltungen zu konstruieren. Dabei wurden im hier vorgestellten Paper verschiedene cI-Varianten mit passenden Promotoren entworfen werden. cI kann hierbei als Repressor oder Aktivator fungieren. Da cI einer der am besten studierten Transkriptionsfaktoren ist, kann dieses Wissen angewendet werden, um kombinatorische cI-Bibliotheken mit modifizierten Operatorbindestellen zu konstruieren, um hiermit neue cI-Varianten gegen konstruierte Promotoren zu selektieren. Ein wichtiger Aspekt ist, dass alle neuen Transkriptionsfaktoren zueinander orthogonal zueinander sind, um letztendlich eine Kreuzreaktivität der selektierten cI-Varianten um Promotorenpaare auszuschließen, bevor diese in Gennetzwerken angewandt werden.

Lambda-Phage und cI-Repressor

Um die im Paper entwickelten Genregulationschaltkreise zu verstehen, ist die Kenntnis der natürlichen Funktionsweise des cI-Repressors an seinem Wirkungsort von wichtiger Bedeutung. Der cI-Repressor ist im Virengenom der E.coli Bakteriophage codiert. Die E.coli-Bakteriophage ist wie der Name schon sagt ein Virus, der E.coli als Wirt zur Vermehrung nutzt (Abb. 1). Das Virus besteht aus einem Capsid oder auch Kopf mit einem Durchmesser von ca. 60 nm. In diesem befindet sich die doppelsträngige DNA. Das Genom ist 48,4 kb groß und codiert für 70 Proteine An den Kopf angeschlossen befindet sich der Schwanz der Phage, an dem sich am Ende die Schwanzfibern befinden mit dem sich das Virus an seiner Wirtszelle anhaftet.

Abb. 1: Aufbau einer Lambda-Phage.

Der cI-Repressor ist im Genom der Lambda-Phage codiert. cI ist einer der am besten studierten Transkriptionsfaktoren und kann als Repressor oder Aktivator fungieren. Es handelt sich hierbei um ein Protein, welches natürlicherweise als Transkriptionsrepressor fungiert und somit den Virus eine Latenzherstellung im Wirt ermöglicht. In Abb. 2 ist die Wirkweise dieses Repressors einmal schematisch dargestellt.

Abb. 2: Natürlicher Bidirektionaler Promotor für Herstellung der Virenlatenz und Selbstregulation von cI.

Der natürliche Operator an dem der cI-Repressor bindet besteht aus zwei Operatorregionen, OL und OR. Diese teilen sich jeweils in drei Operatorbindestellen auf. OL besteht aus den Bindestellen OL1,OL2 und OL3. OR besteht aus OR1, OR2, OR3. Der cI-Repressor hat die Funktion die die beiden Operatoren OL und OR zusammen zu klemmen, indem das Protein an ihnen bindet und die dazwischenliegende DNA in einer Schleife anordnet wie in Abb. 2 zu sehen ist. Dadurch werden. Dadurch werden die lytischen Promotoren unterdrückt. Die Bindung an OR2 hat aktiviert zusätzlich die Transkription des cI-Gens wodurch eine autoregulatorische Funktion zur Aufrechterhaltung des latenten Zustands vermittelt wird. Sobald cI in ausreichender Menge vorhanden ist, kann es die eigene Transkription durch Bindung an OL3 und OR3 unterdrücken. Der Repressor cI wirkt an dem hier im Bild dargestellten bidirektionalen Promotor.

Methoden

Um ein neues Set von orthogonalen Transkriptionsfaktoren zu generieren, wurden vier Schritte durchgeführt (Abb. 3).

Abb. 3: Schematischer Ablauf der Generierung von orthogonalen Transkriptionsfaktoren für synthetische Promotoren mit mehreren Bindestellen.

Im ersten Schritt der orthogonalen Transkriptionsfaktoren wurde eine kombinatorische cI-Phagen-Bibliothek erstellt. Es wurden dabei verschiedene cI-Varianten generiert und diese jeweils in eine Phage eingeschleust. Im zweiten Schritt wurden verschiedene synthetische Promotoren erstellt, welche sich jeweils in diversen Basen unterschieden. Im dritten Schritt wurden nun die cI-Varianten mittels einem Phagen-basierten System selektiert. Im vierten und letzten Schritt wurden die selektierten cI-Varianten charakterisiert und auf Orthogonalität getestet. Dies wurde mit einem GFP/mCherry Reportersystem realisiert.

Phagmid-basiertes System für die Selektion von kombinatorischen Bibliotheken

Um neu generierte Transkriptionsfaktor- und Promotorkombinationen zu selektieren wurde hier im Paper ein Phagmid-basiertes System verwendet. Das System bietet grundsätzlich alles was für die Phagenproduktion benötigt wird auf einem Helfer Phagen-Plasmid (HP) außer zwei fehlende Virengene, Gen III und Gen VI. Ein zweites Zusatzplasmid enthält einen an Bedingungen geknüpften Genschaltkreis welches den zu aktivierenden Promotor mit Gen IV enthält. Ein drittes Plasmid, hier benannt als Phagmid (PM), weil es in eine infektiöse Phage geschleust werden kann enthält Gen III und eine kombinatorisch zufällige Reihe an Transkriptionsfaktoren. Diese Transkriptionfaktoren wiederrum können das fehlende Gen IV aktivieren und damit den Phagenzyklus vervollständigen. Wenn dies der Fall wäre, würde eine Akkumulation dieses cI-Varianten stattfinden. Auf diesem Weg und durch Änderung des Promotordesigns kann eine Reihe neuer Transkriptionsfaktoren und Promotoraktivitäten selektiert werden.

In Abb. 4 ist nun noch einmal ein Schema des Phagmid-basierten Systems für die Selektion der cI-Varianten zu sehen, um dieses System besser zu verstehen. Im ersten Schritt werden Phagen jeweils mit verschiedenen cI-Bibliotheks-Mitgliedern bestückt. Weiterhin befindet sich ebenfalls das Gen III mit in der Phage. Im zweiten Schritt infiziert die Phage kultivierte E.coli-Zellen, die bereits das Zusatzplasmid (AP) und auch Helferplasmid (HP) enthalten. Das Helferplasmid enthält alle Phagengene bis auf Gen III Gen IV. Das Zusatzplasmid enthält den an Bedingungen geknüpften Gen IV Expressionsschaltkreis. Nun befinden sich alle Komponenten zur Phagenproduktion in der E.coli-Zelle. Befindet sich nun eine cI-Proteinvariante mit gewünschter Charakteristika, führt dies zu einer hochregulierten Gen IV-Genexpression und dadurch zu einer steigenden Phagenproduktion wie in Schritt 3 zu sehen. Im 4. Schritt werden die assemblierten Phagen mit funktionierenden cI-Varianten freigesetzt und können im nächsten Zyklus erneut E.coli infizieren. Dies führt nach einer gewissen Zeit zu einer Anreicherung/Akkumulation dieser funktionieren cI-Varianten. Dadurch können die cI-Proteinvarianten herausselektiert werden, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen.

Abb. 4: Phagmid- basiertes System für die Selektion der kombinatorischen cI-Bibliotheken.

Konstruktion synthetischer Promotoren und cI Bibliotheken

Im nächsten Schritt wurden synthetische bidirektionale Promotoren entwickelt, die orthogonal zur Wildtypaktivität sind. Jeder Bidirektionale Promotor besteht hierbei aus 3 Operatorbindestellen O1,O2 und O3.

In Abb. 5 ist nun die Promotorarchitektur noch einmal schematisch dargestellt.PR/PRM ist der normale Promotor und ebenfalls die Konsensussequenz (CS). Nun wurden verschiedene Promotoren entwickelt, bei denen die Operatoren jeweils einen Konsensusanteil und einen Nicht-Konsensus-Anteil aufweisen.

Abb. 5: Promotorarchitektur des bidirektionalen Promotors PR/PM.

Jeder Promotor enthält dadurch verschiedene Sequenzen. Wenn die Transkriptionsfaktoren an O2 binden führt dies zu einer verbesserten DNA-Polymerase-Aktivität und somit zur Transkriptionsaktivierung von PM. Die Bindung des Transkriptionsfaktors an an O1 hilft bei diesem Prozess und resultiert in einer verbesserten Transkriptionsfaktoraffinität zu O2. Die Bindung an O1 führt außerdem zur Repression von P, wohingegen eine Repression von PM durch Bindung an O3 erzielt wird. Wie bereits im ersten Abschnitt angeschnitten sind die entwickelten synthetischen Promotoren symmetrische Varianten der Konsensus lambda-Sequenz (CS), die auf den 6 natürlichen Operatoren (OL1, OL2, OL3, OR1, OR2 und OR3) basieren. Jeder neue Promotor besteht aus dem neuen mutierten Operator auf Position O1 und O2, wohingegen die O3-Bindestelle inaktiviert wird, um eine Autorepression bei hohen cI-Konzentrationen zu umgehen. Eine Charakterisierung der neu erschaffenen PM und PR-Promotoren wurde durch eine GFP und mCherry-Expression in Relation zu den Konsensus PM und PR-Promotoren charakterisiert. GFP und mCherry sind hier die zwei Gene, die für die gleichnamigen Proteine codieren. mCherry ist an den Promotor P geknüpft und kann mittels den Operatorbindestellen O1 und O2 inhibiert werden. GFP ist an den Promotor PM geknüpft.

In Abb. 6 ist das cI-Bindeassay einmal schematisch dargestellt. GFP und mCherry sind die zwei Gene die für die gleichnamigen Proteine codieren. mCherry ist an den Promotor P geknüpft und kann mittels den Operatorbindestellen O1 und O2 inhibiert werden. GFP ist an den Promotor PM geknüpft. In der oberen Abbildung ist nun der neu designte Promotor mir den veränderten Operatoren O1, O2 und dem unveränderten O3 zu sehen. Der natürliche cI-Inhibitor kann hier nicht binden, da die Bindestellen für diesen verändert sind. Somit kann die RNA-Polymerase sowohl an den Promotor P als auch an dem Promotor PM binden. Dadurch kann eine Richtung in beide Richtungen ablaufen. Es wird sowohl mCherry als auch GFP exprimiert. In der unteren Abbildung ist der natürliche Promotor zu sehen. An diesem kann der natürliche cI-Repressor an O1 und O2 binden und somit den Promotor Pr inhibieren. Somit kann hier eine Expression von GFP stattfinden aber keine Expression von mCherry.

Abb. 6: cI-Bindesassay.

Selektion und Charakterisierung von cI-Bibliotheksvarianten

Bei der Selektion wurde wie schon im oben beschriebenen Phagmid-basierten Selektionssystem ein Zubehörplasmid konstruiert für eine Kombination von Mutant cI-Selektion und gleichzeitiger Wildtyp-  Gegenselektion der Gen IV Induktion. Weil der natürliche Lambda PR/PM-Promotor wie weiter oben erklärt drei Operatorbindestellen besitzt, die nach cI-Bindung sowohl Aktivierung als auch Repression vermitteln bietet dieses System sowohl die Funktion der Selektion mittels Aktivierung als auch mittels Repression. Die ausgelöschte O3-Bindestelle wird hier nun durch die Konsensus-Wildtyp-Sequenz (OCS) ausgetauscht. Somit aktiviert die Bindung von einem cI-Bibliotheksmitglied auf dem mutierten O1-O2 die Gen IV-Expression und Selektion, währenddessen eine gleichzeitige Bindung an WT O3 (OCS) das Gen IV reprimieren. Dies ermöglicht eine Gegenselektion gegen eine kreuzreagierende Wildtypaktivität. Auf jedem AP-Plasmid wurde diese Gegenselektion eingebracht, um die Selektionseffizienz zu steigern. Die Bibliotheken wurden im Anschluss gegen die entwickelten Promotoren für 6-8 Runden selektiert. Dies führt dazu, dass sich die Transkriptionsfaktoren, die Bindeaktivierung gegen ihre Promotoren aufweisen. Die selektierten Transkriptionsfaktoren wurden mittels des oben beschriebenen Bindeassays auf Aktivierung und Repression analysiert.

Aufbau und Antwortfunktion eines Logikgatters mit mehreren Eingängen

Die in diesem Paper synthetisierten Transkriptionsfaktoren und Operatoren ermöglichen die Konstruktion einer breiten Palette von logischen Funktionen durch die Entwicklung der Promotorarchitektur. Variationen der 3 Operator-Sequenz (O1-O2-O3) und Position ermöglichen die Konstruktion von unidirektionalen oder bidirektionalen Promotoren mit ein, zwei oder drei Transkriptionsfaktorbindungen. In diesem Paper wurden nun mehrere integrierte Gennetzwerke, die auf orthogonalen cI-Varianten basieren konstruiert. Im Paper wurden mehrere Genschaltkreise vorgestellt. Hier werden nun einmal zwei dieser Schaltkreise vorgestellt.

Im ersten hier konstruierten Gennetzwerk wurden (Abb. 7) besteht aus zwei Sensoren. Diese stellen das lacI- und das araC- Gen. Außerdem enthält der Schaltkreis 2 cI-Varianten. Einmal den natürlichen cI-Repressor und die cI5C6A-Variante. Der bidirektionale Promotor wurde für zwei Bindestellen designt. cI5C6A bindet an O1 und O2 und cI bindet an O3. Wie im Schaltkreis zu sehen, wurde die Expression der beiden cI-Varianten an die Sensoren geknüpft. Das LacI-Gen wird durch Anwesenheit IPTG reprimiert, wobei die im Folgeschritt zur Expression von cI5C6A führt. Ist also IPTG vorhanden kann cI5C6A gebildet werden, ist es nicht vorhanden wird cI5C6A nicht exprimiert. Der andere Sensor araC wird konstitutiv exprimiert. Dies führt zur Reprimierung der Expression von cI. Ist jedoch Arabinose (Ara) vorhanden, so kann cI durch die Aktivierung des daran gekoppelten Promotor pBAD exprimiert werden. Wenn die Variante cI5C6A exprimiert wird aktiviert diese die Expression von dem Reportergen GFP und hemmt gleichzeitig die Expression des Reportergens mCherry. Wenn cI exprimiert wird, hemmt dieses lediglich die Expression von GFP.

Abb. 7: Konstruiertes Gennetzwerk mit zwei Sensoren und zwei cI-Varianten und bidirektionalen Promotor.

In dem in Abb. 8 gezeigten Genschaltkreis sind nun drei cI-Varianten integriert. Jeder dieser cI-Varianten ist wieder an einen Sensor gekoppelt. cI ist an das Gen araC gekoppelt. Wenn Arabinose vorhanden ist, so wird das araC-Gen reprimiert und somit kann cI exprimiert werden. Ist keine Arabinose vorhanden dann wird araC exprimiert und das Genprodukt von araC bindet an den Promotor pBAD der vor dem cI-Gen liegt und somit im Folgeschritt die Expression von cI. Die Variante cI5C6A ist wie auch schon im ersten Schaltkreis an LacI geknüpft. Ist IPTG vorhanden so wird die Expression von LacI reprimiert und cI5C6A kann exprimiert werden. Ist IPTG nicht vorhanden so bindet das Genprodukt von lacI an den Promotor pLlac der vor cI5C6A liegt und reprimiert dadurch die Expression dieser cI-Variante. Der Unterschied zum ersten Schaltkreis ist, dass bei diesem wie schon erwähnt drei Sensoren und drei cI-Varianten besteht. Die dritte cI-Variante die hier eingesetzt wurde ist cI5G6G,P. Diese Variante wird durch zwei Bedingungen exprimiert. Das LuxR-Gen wird konstitutiv exprimiert und ist eine Bedingung. Die zweite Bedingung ist das Vorhandensein des Enzyms 3OC6. Werden beide Bedingungen erfüllt so wirken diese beiden Komponenten aktivierend auf den Promotor pLux, der vor cI5G6G,P liegt. Somit wird die Expression dieser Variante aktiviert. Im Gegensatz zum ersten Schaltkreis wurden in diesem Schaltkreis zwei unidirektionale Promotoren integriert. An einem Promotor ist das Gen für GFP gekoppelt und kann mittels cI und cI5C6A reguliert werden. An den anderen Promotor ist das Reportergen mCherry geknüpft und kann mittels cI und cI5G6G,P reguliert werden. Der Repressor cI induziert bei beiden Promotoren eine Repression der Reportergene. cI5C6A induziert am Promotor eine Aktivierung des Gens GFP. Ebenso induziert cI5G6G,P eine Aktivierung des Gens mCherry.

Abb. 8: Konstruiertes Gennetzwerk mit drei Sensoren und drei cI-Varianten und zwei unidirektionalen Promotoren.

Quellen

Bildquellen

einfuehrung/orthogonaltfs.txt · Zuletzt geändert: 2020/12/18 18:12 von Röbbe Wünschiers
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