Synthetische Biologie – Themen

Synchrone Langzeit-Oszillationen

von Mariam Rohmorser

Nicht jeder Mensch ist für den Nachtdienst geeignet. Auch der Sekundenschlaf beim Autofahren kommt selten tagsüber vor, sondern eher bei Nachtfahrten. Und nach einer langen Flugreise kämpfen viele Menschen mit den Symptomen eines Jetlags: Müdigkeit und Leistungsschwäche. Ob es gerade helllichter Tag ist oder tiefdunkle Nacht entscheidet in großem Umfang darüber, wie leistungsfähig wir sind, wie gut wir uns konzentrieren können, was für hormonelle Signale uns beeinflussen und so weiter. Licht oder Dunkelheit, das sind klare Umgebungsbedingungen, die Einfluss auf uns nehmen. Allerdings wäre es ungünstig, wenn Menschen beim Gang in den Keller sofort einschlafen, nur weil kurzzeitig das Sonnenlicht fehlt.

Die zirkadiane Uhr

Hier kommt die sogenannte zirkadiane Uhr ins Spiel. Man findet sie in vielen Lebewesen und sie bleibt wie eine mechanische Uhr auch ohne äußere Einwirkung für einige Zyklen stabil. Bei Cyanobakterien bleibt der Rhythmus durch eine Kombination von Kontrollmechanismen transkriptionaler und post-translationaler Natur sogar über Wochen konstant. Durch äußere Faktoren können die Oszillationen wieder synchronisiert und richtig „eingestellt“ werden. Sonnenlicht ist hier ein omnipräsenter Taktgeber zum Nachjustieren der Uhr. Erst durch dieses Zusammenspiel kann ein 24-stündiger Rhythmus entstehen, der uns und andere Lebewesen darin unterstützt, angepasst an die Umwelt zu leben.

Synchrone Langzeit-Oszillationen spielen in der Natur also eine wichtige Rolle, wenn es um den Tag-Nacht- Rhythmus geht. Synchron müssen hierbei z.B. die vielen Körperzellen eingestellt sein, damit sich nicht eine Zelle in einem ganz anderen Zustand befindet als ihre Nachbarin. Langzeit bedeutet beim Wechsel von Tag und Nacht eine Periodenlänge von 24 Stunden, sodass man genau 1 Schlafpause pro 24 Stunden im Bett verbringt (auch wenn manche Mittagsschlaffreunde eine kürzere Periodenlänge zu haben scheinen). Ebenso ist sehr angenehm, wenn man jeden Morgen nach dem Weckerklingeln die gleiche unbändige Energie hat und nicht ständigen Schwankungen unterlegen ist. Oszillationen sind idealerweise also gleichmäßiger Natur. Aber wer schon einmal Sinuskurven freihand gezeichnent hat, weiß wie schwierig das sein kann.

Und genau das ist das Problem, wenn man versucht, mithilfe der synthetischen Biologie gleichmäßige und robuste Oszillationen zu erzeugen, die als orthogonales System [siehe Einführung „Orthogonale Systeme“] auch in unterschiedlichen Zellen und unter verschiedenen Umgebungsbedingungen unverändert im Takt bleiben. Eine Uhr sollte schließlich auch nicht schneller ticken, wenn die Zimmertemperatur nach dem Stoßlüften absinkt oder dadurch plötzlich wieder mehr Sauerstoff in der Luft ist.

Der Repressilator

Beim Repressilator handelt es sich um einen genetischen Schaltkreis, der Oszillationen erzeugen kann [siehe Einführung „Genetische Schaltkreise“]. Im Unterschied zum bereits in der Einführung beschriebenen bistabilen Zustand befindet sich das System bei Oszillationen nicht in verharrenden, sondern in kreislaufartig wechselnden Zuständen. Der Repressilator in seiner ursprünglichen Form wurde im Jahr 2000 konstruiert. Er besteht aus zwei Plasmiden, also ringförmigen DNA-Strängen (siehe Abbildung 1, oben).

Abb. 1: Der Repressilator aus dem Jahr 2000. Oben) Genetischer Schaltkreis, der Oszillationen erzeugen kann. Das Repressilatorplasmid fungiert als Schaltkreis, von dessen Zustand der Zustand des Reporterplasmids abhängig ist. Der Reporter besitzt das Gen gfp zur Produktion des grün fluoreszierenden Proteins GFP, mit dessen Hilfe die Oszillationen visualisiert werden können. Gesteuert wird gfp durch den Promotor Ptet. Auf dem Repressilator befinden sich drei Gene (tetR, lacI und λcI), die jeweils für Repressoren kodieren: den Tetracyclin-, Lamda- und lacI-Repressor (TetR, CI und LacI). Die Repressoren binden jeweils einen bestimmten Promotor (Ptet, λPR oder Plac) und reprimieren das nachgeschaltete Gen. Synchronisiert werden kann der Schaltkreis in mehreren Zellen durch Zugabe von IPTG, einem Laktoseanalogon, das den Promotor Plac induziert und zur Synthese von TetR führt. Weiterhin ist der Replikationsursprung der Plasmide (Ori) zur erkennen. Unten) Die entstehenden Oszillationen können durch die Fluoreszenz von GFP visualisiert werden. GFP oszilliert nur dann regelmäßig und synchron, wenn auch die zugehörigen Bestandteile des Schaltkreises synchron oszillieren, darunter die Repressoren TetR, LacI und CI.

Das eine Plasmid fungiert als Reporter. Auf ihm befindet sich das Gen gfp zur Synthese von GFP, dem grün fluoreszierenden Protein. Abhängig davon, ob und wie viel GFP vorhanden ist, lässt sich eine deutliche grüne Fluoreszenz erkennen. Vom dazugehörigen Promotor (Ptet) ist wiederum abhängig, ob das Gen gfp zur Produktion von GFP abgelesen werden kann oder nicht.

Der Reporter kann sich also in zwei Zuständen befinden:

  • aktiver Zustand des Reporters: Bildung von GFP → Fluoreszenz
  • reprimierter Zustand des Reporters: keine Bildung von GFP

Der eigentliche Schaltkreis, von dessen Zustand der Zustand des Reporters abhängig ist, befindet sich auf dem zweiten der beiden Plasmide, dem Repressilator. Auf ihm befinden sich drei Gene (tetR, lacI und λcI), die jeweils für Repressoren kodieren: den Tetracyclin-, Lamda- und lacI-Repressor (TetR, CI und LacI). Diese Repressoren inaktivieren jeweils das vorige benachbarte Gen, indem sie an dessen Promotor binden – und zwar solange, bis biologische Abbauprozesse die Proteine wieder eliminieren.

Die Repressoren binden wie folgt an die (den Genen vorgeschalteten) Promotoren und stoppen die Synthese des Genprodukts:

Repressor + Promotor Gen (kodiert für Protein)
TetR + Ptet gfp (GFP)
CI + λPR lacI (LacI)
LacI + Plac tetR (TetR)

Schaut man sich die Abbildung 1 an, kann man sich den Kreislauf verdeutlichen, wobei dieser synchron mit der Zugabe des Plac-Induktors IPTG gestartet werden kann. Dabei spielt das Gen tetR eine Schlüsselrolle, denn das gebildete Protein TetR reprimiert (durch Bindung an den Promotor Ptet) zwei Gene: gfp und λcI. Es versetzt also den Reporter direkt in den inaktiven, d.h. reprimierten Zustand (keine Fluoreszenz) und sorgt gleichzeitig dafür, dass die Bildung des Repressors CI gestoppt wird. Ohne die Anwesenheit von CI kann lacI abgelesen und LacI gebildet werden. LacI reprimiert allerdings tetR. Wird die Synthese von TetR gestoppt und das zuvor gebildete und noch vorhandene TetR proteolytisch abgebaut, lässt auch die Repression von gfp und λcI wieder nach, sodass nun der Reporter in den aktiven Zustand „umschaltet“ und GFP gebildet werden kann – zu Beobachten durch das grüne Leuchten des fluoreszierenden Proteins. Wenn nun λcI wieder abgelesen werden kann, führt das gebildete CI zur Repression von lacI. Ohne Neusynthese von LacI wird der vorhandene Bestand jedoch abgebaut und gibt tetR wieder „frei“, sodass neue TetR- Repressoren synthetisiert werden können. Der Zyklus ist geschlossen und eine Periode beinhaltet diesen kreislaufartigen Ablauf.

Der Repressilator als synthetisches Konstrukt stellte eine Sensation dar. Jedoch war das oszillierende Leuchten der Zellen noch recht unregelmäßiger Natur. 2016 erst wurde er derart weiterentwickelt, dass er sehr regelmäßige und langanhaltende ungekoppelte Oszillationen zeigt (siehe Abbildung 2).

Abb. 2: Synchron fluoreszierende Flüssigkultur. Die Zellen leuchten mit einer Periodenlänge von etwa 5 h grün. Taktgeber war hier IPTG, das zu Beginn den Zellen hinzugefügt wurde und den Repressilator-Schaltkreis in allen Zellen in den selben Zustand versetzt hat – zum Erzeugen synchroner Fluoreszenz (verändert nach [1]).

Abbildung 2 zeigt eine flüssige Kultur, deren Zellen mit einer Periodenlänge von etwa 5 h grün fluoreszieren – und zwar synchron. Erreicht wurde diese Präzision durch mehrere Reduktionen und Veränderungen des originalen Repressilators.

Zum einen wurde die Funktion des Reporters in das Plasmid des Repressilators integriert. Denn es zeigte sich in Modellierungen, dass die langsame Replikation, die der Reporter aufweist, gegenüber der schnellen des Repressilators ein Problem bei Zellteilungen darstellt. Wenn die Plasmide sich unterschiedlich schnell und unabhängig von ihrer Wirtszelle vermehren, liegen im Moment der Zellteilung unterschiedlich viele Plasmide von Repressilator und Reporter vor. Dadurch kann ein unterschiedliches Verhältnis in den zwei entstehenden Tochterzellen die Folge sein. Geschieht das, wirkt sich das unmittelbar auf die synthetisierte Menge an Proteinen aus. Dann kann es sein, dass die Anzahl an Repressorproteinen variiert und in der einen Tochterzelle mehr GFP gebildet wird als in der anderen. Das macht sich natürlich in abweichenden Amplituden bemerkbar, letztendlich also in der Intensität des Leuchtens. Wie eingangs bei der zirkadianen Uhr geschildert, liegt in regelmäßigen Amplituden aber eine nicht unerhebliche Bedeutung.

Eine weitere der Anpassungen bezog sich auf die Markierungen zum proteolytischen Abbau (sogenannte Tags), mit denen die Proteine entworfen worden waren. Durch eine Konkurrenz um dieselben Proteasen kam es zum ungleichmäßigen Abbau der Repressorproteine und damit zu Unregelmäßigkeiten in der Oszillation. Diese Fehlerweiterleitung durch das Proteolysesystem konnte durch eine Entfernung der Degradation-Tags gestoppt werden. Gleichzeitig führte das zu einer Vervierfachung der Periodenlänge. Das liegt nahe, denn wenn die Repressoren nicht so schnell abgebaut werden und länger wirksam sind, verhindern sie dementsprechend auch länger die Neusynthese des nächsten Repressorproteins und so weiter. Das Ergebnis von 10 Generationen an Bakterienzellen entsprach dem Ziel von Langzeit-Oszillationen eher als die ursprüngliche Periodenlänge von 2,4 Generationen.

Das veränderte Repressilatorsystem bleibt zudem auch verschiedenen äußeren Einflüssen gegenüber sehr stabil, was orthogonale System auszeichnet. Dabei wurde der Einsatz in verschiedenen Zellen und mit unterschiedlichen Nährmedien getestet, sowie Temperaturen von 37 °C, 30°C oder auch 25 °C.

Beim Repressilator handelt es sich also um ein ungemein spannendes genetisches Konstrukt, das unter anderem dabei hilft, die innere Uhr in uns und anderen Lebewesen besser zu verstehen, mithilfe derer langanhaltende ungekoppelte Oszillationen erzeugt werden können. Vielleicht können hiermit in Zukunft auch Erkrankungen wie die „Zirkadiane Schlaf-Wach-Rhythmusstörung“ besser verstanden und behandelt werden. Taktgeber ist beim Repressilator zwar nicht das Sonnenlicht, sondern die Substanz IPTG, allerdings ist das Grundprinzip dieser synchronen Langzeit-Oszillationen dasselbe wie bei der oben beschriebenen zirkadianen Uhr.

Bildquellen

  • Potvin-Trottier, L., Lord, N., Vinnicombe, G. et al. Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature 538, 514–517 (2016). doi: https://doi.org/10.1038/nature19841

Literaturquellen

  • Potvin-Trottier, L., Lord, N., Vinnicombe, G. et al. Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature 538, 514–517 (2016). doi: https://doi.org/10.1038/nature19841
  • Beck CF, Mutzel R, Barbé J, Müller W. A multifunctional gene (tetR) controls Tn10-encoded tetracycline resistance. J Bacteriol. 1982;150(2):633-642. doi:10.1128/JB.150.2.633-642.1982
einfuehrung/oscillators.txt · Zuletzt geändert: 2021/01/21 13:48 von Röbbe Wünschiers
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